猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)首先在北美洲和欧洲发现，我国于1995年首次分离到PRRS病毒(PRRS Virus，PRRSV)。该病的临床表现为妊娠母猪流产、死胎、弱胎、木乃伊胎等繁殖障碍、各年龄阶段猪的呼吸道症状、哺乳仔猪的高死亡率、免疫抑制和持续性感染等症状，是目前严重危害我国乃至世界养猪业的最重要的传染病之一。高致病性PRRSV2006年在我国首次出现，其致病能力显著增强，造成严重的经济损失，引起人们高度关注。　　 PRRSV侵入宿主细胞首先通过与细胞膜表面上的特异性受体结合，利用细胞内吞作用而感染易感细胞，如猪肺泡巨噬细胞PAM和猴肾细胞系及其衍生细胞系(MA-104，Marc-145，HS.2H，CL-2621)。目前发现的细胞受体主要包括：似肝磷脂蛋白、唾液酸粘附素、波形蛋白、清道夫CD163蛋白和非肌肉肌球蛋白Ⅱ型重链A受体。CD163受体属于富含半胱氨酸残基的清道夫受体蛋白超家族成员，包括9个胞外区的SRCR区域、2个PST富集区域、1个跨膜区域和1个胞浆尾区域。Calvert发现CD163受体的前2个SRCR区域缺失不影响PRRSV的感染，由此可以推测前x个SRCR区域不是PRRSV感染细胞所必须的。为了弄清哪一个SRCR区域在CD163作为PRRSV感染细胞受体中具有重要作用，本研究构建了表达野生型的CD163受体和缺失不同个数SRCR区域的CD163受体突变体的质粒。将这些质粒转染BHK细胞24 h后，用XH-GD株PRRSV感染这些细胞后，进行IFA分析。结果显示前4个SRCR重复区缺失不影响PRRSV的感染。为了进一步证实这一结果，将tD4 CD163和tD5CD163基因克隆到原核表达载体，构建质粒pET-28a-tD4 CD163和pET-28a-tD5CD163。再将质粒转化表达菌BL21(DE3)，并诱导蛋白表达。研究发现当重悬缓冲液中加入β-巯基乙醇、尿素、Tween20、甘油和SDS时，可溶性蛋白明显增加。将tD4 CD163和tD5 CD163蛋白纯化后免疫BALB/c鼠，Western blot显示tD4 CD163和tD5 CD163蛋白可以被tD5 CD163抗血清识别：ELISA结果显示以tD5 CD163蛋白作为包被蛋白，tD4 CD163和tD5 CD163抗血清的滴度为1：160。在用tD4 CD163抗血清阻断表达D0 CD163和D4 CD163蛋白的BHK细胞后，用XH-GD株PRRSV感染细胞，IFA分析说明具有阻断效果，qPCR证实这一阻断作用具有一定的浓度依赖性。但这一阻断作用在Marc-145细胞上的效果并不理想，可能与其他受体的协同作用有关。用tD5 CD163抗血清阻断表达D4 CD163蛋白的BHK细胞后，用XH-GD株PRRSV感染细胞，IFA分析说明这一阻断效果明显下降，说明SRCR5是PRRSV感染细胞所必需的。　　 近年来的研究表明，一些小的双链RNA可以高效、特异地诱导体内特定基因表达产物的降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，称为RNA干扰(RNA interference，RNAi)。本研究构建了能够表达针对PRRSV的Lead基因的特异性siRNA的质粒，表明该质粒表达的siRNA能够抑制PRRSV在Marc-145细胞中的增殖，为抗PRRSV提供了新的方法。　　 本研究还成功构建了PRRSV反向遗传操作平台。PRRSV全长cDNA的构建策略：PRRSV全长cDNA的构建分6个片段进行，先由A1和A2片段或B1和B2片段连接构成A片段或B片段，然后D、C、B和A片段依次亚克隆入pOKq载体。在基因组2端分别加上CMV启动子序列和BGH终止信号肽，全基因组510位核苷酸突变引入遗传标记位点FseⅠ。测序正确的全基因组质粒命名为pOK-A2BCD。再将pOK-A2BCD质粒转染BHK细胞，拯救病毒通过PCR、酶切、测序和IFA鉴定。在此基础上构建了带帽子结构和不带帽子结构的病毒，初步研究发现：帽子结构影响病毒的拯救，但有利于病毒的增殖。　　 GP5蛋白，由ORF5基因编码，是PRRSV重要的结构蛋白之一，能产生中和抗体，在机体抗病毒中具有重要作用；该蛋白借助于唾液酸粘附素等受体进入细胞。所以了解ORF5基因的遗传进化关系，对于PRRSV的防控具有重要的作用和意义。为此，收集广东省2007～2010年的疑似PRRSV样品。结果表明：2007～2009年华南地区PRRSV流行毒株分布在4个基因亚型(SubgenotypeⅠ，Ⅲ，Ⅴ和Ⅵ)，大部分病毒属于Ⅰ亚型。Ⅰ和Ⅲ亚型在此区域的变异个数比Ⅴ和Ⅵ亚型的多；Ⅰ和Ⅲ亚型的39位氨基酸由F/L变为Ⅰ，少数毒株的39位氨基酸由F/L变为S。从糖基化位点来看，Ⅱ亚型、Ⅴ亚型和Ⅵ亚型的糖基化位点比Ⅰ亚型的少。从2007～2010年华南地区PRRSV进化关系分析来看，华南地区出现了新的类日本和台湾地区的基因型，这一新的基因型值得关注。本研究为PRRSV的分子进化提供了新的证据。　　 本研究将2007年分离的XH-GD株在Marc-145细胞上连续传代，得到了122个不同代次的毒株。在此基础上对其中的13个病毒进行研究，结果表明：在体外增殖过程中，随着代次的增加，病毒的滴度呈现升高趋势，相反，产生病变的时间呈现缩短趋势。病毒在体外增殖过程中，有34个氨基端位点发生变化。其中，NSP11(1238)、ORF3(143)和ORF5a(2)均出现带苯环的氨基酸向不带苯环的氨基酸的变化，还存在一些带电荷的氨基酸和不带电荷的氨基酸之间的转变。通过了解病毒在体外增殖过程中的病毒滴度变化和遗传演化，为进一步研究与PRRSV致病相关的位点和筛选出一个有效的疫苗候选株奠定基础。