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近年来,妊娠胚胎发育期的应激反应对子代成年后疾病的发生发展具有重大影响的学说逐渐得到接受,不少疾病发病机制研究已经开始聚焦到母体与子代的关系。脑卒中是导致人类死亡的三大疾病之一,严重影响人类的预期寿命和生活质量。尽管有大量文献发现缺血性脑损伤是多种因素共同作用的结果,包括自由基损伤、兴奋性氨基酸的毒性、钙超载、细胞凋亡、氧化应激、炎症反应等,但其最早发生的时间和机制还未明确,因此,对脑卒中早期的发病机制进行深入的探讨,将有益于找寻合适的治疗方法。许多研究报道表明,炎症反应在缺血性脑损伤中发挥了重要的作用。COX-2是机体在病理情况下产生的诱导型环加氧酶,即可以氧化花生四烯酸等游离脂肪酸,也直接氧化结合形式的多烯脂肪酸,参与机体多种炎症反应的发生,并通过调控炎症反应诱导细胞凋亡。本研究主要观察产前炎症免疫应激是否可以通过COX-2-PGD2-DPs途径激活改变子代机体对缺血性中风脑损伤的易感性。第一部分孕期炎症子代大鼠局灶缺血再灌注损伤脑COX-2-PGD2-DPs途径变化特征目的:观察孕期炎症刺激对子代大鼠局灶缺血再灌注脑损伤易感性的影响;初步考察孕期炎症子代大鼠局灶性缺血再灌注损伤脑组织COX-2-PGD2-DPs途径变化特征。方法:1.实验处理及分组:选取30只通过检查阴栓获得准确妊娠时间的SD孕鼠,随机选择10只作为正常对照组,20只孕鼠在孕第11、14、18天予以300μg/kg LPS腹腔注射进行孕期炎症处理。随机选取48只出生后60天子代雄性大鼠,体重220-250g,子代大鼠采用大脑中动脉栓塞90分钟再灌注24小时建立大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型（MCAO）,分为以下四组:（1）N+Sham组:孕鼠在孕第11、14、18天予以生理盐水0.5mL i.p.,子鼠进行假手术处理。（2）LPS+Sham组:孕鼠在孕第11、14、18天予以LPS 300μg/kg i.p.,子鼠进行假手术处理。（3）N+MCAO组:孕鼠在孕第11、14、18天予以生理盐水0.5mL i.p.,子鼠进行局灶性缺血再灌注处理。（4）LPS+MCAO组:孕鼠在孕第11、14、18天予以LPS 300μg/kg i.p.,子鼠进行局灶性缺血再灌注处理。2.观察指标:大鼠进行神经行为缺陷评分和脑组织TTC染色;HE染色观察大鼠海马及皮层组织病理学变化;生化酶学测定大鼠脑组织SOD和MDA水平;ELISA测定大鼠海马及皮层TNF-α、IL-1β、IL-6以及PGD2含量变化;Western blotting测定大鼠海马及皮层COX-2、DP1/2、caspase-9、caspase-3、cleaved caspase-3以及Bcl-2蛋白表达。结果:（1）LPS+Sham组与N+Sham组大鼠的神经评分无显著性差异（P>0.05）;分别与N+Sham组和LPS+Sham相比,N+MCAO组和LPS+MCAO组大鼠神经功能缺陷评分均明显升高（P<0.001）;与N+MCAO组相比,LPS+MCAO组大鼠的神经功能缺陷评分均明显升高（P<0.01）。（2）N+Sham组和LPS+Sham组均未见明显白色梗死区域;分别与N+Sham组和LPS+Sham相比,N+MCAO组和LPS+MCAO组大鼠脑梗死容积百分比均明显升高（P<0.001）;与N+MCAO组相比,LPS+MCAO组大鼠脑梗死容积百分比显著上升（P<0.001）。（3）N+Sham组和LPS+Sham组神经细胞排列紧密,多数细胞呈圆形或椭圆形,细胞体较大,但与N+Sham组相比,LPS+Sham组神经细胞死亡率明显增加（P<0.05&P<0.01）;分别与N+Sham组和LPS+Sham组相比,N+MCAO组和LPS+MCAO组大鼠海马及皮层的神经元均出现明显的细胞核固缩和核深染,神经细胞死亡率均显著升高（P<0.001）;与N+MCAO组相比,LPS+MCAO组神经元核固缩和核深染的现象明显增加（P<0.001）。（4）与N+Sham组相比,LPS+Sham组大鼠海马及皮层中SOD活性明显降低（P<0.01）,MDA含量明显增加（P<0.001）,TNF-α、IL-6、IL-1β及PGD2的含量明显升高（P<0.05）;分别与N+Sham组和LPS+Sham组相比,N+MCAO组和LPS+MCAO组大鼠海马及皮层SOD活性明显降低（P<0.01）,MDA含量明显增加（P<0.001）,TNF-α、IL-6、IL-1β及PGD2的含量明显升高（P<0.05&P<0.01&P<0.001）;与N+MCAO组相比,LPS+MCAO组大鼠海马及皮层SOD活性明显降低（P<0.001）,MDA含量明显增加（P<0.001）,TNF-α、IL-6、IL-1β及PGD2的含量明显升高（P<0.05）。（5）与N+Sham组相比,LPS+Sham组大鼠海马及皮层COX-2、DP2、caspase-3、cleaved caspase-3及caspase-9蛋白表达明显升高（P<0.01&P<0.05）,DP1及Bcl-2表达明显降低（P<0.05）;分别与N+Sham组和LPS+Sham组相比,N+MCAO组和LPS+MCAO组大鼠海马及皮层COX-2、DP2、caspase-9、caspase-3及cleaved caspase-3蛋白表达明显升高（P<0.01&P<0.05）,DP1及Bcl-2表达明显降低（P<0.05）;与N+MCAO组相比,LPS+MCAO组大鼠海马及皮层COX-2、DP2、caspase-9、caspase-3及cleaved caspase-3蛋白表达明显升高（P<0.01&P<0.05）,DP1及Bcl-2表达明显降低（P<0.05）。结论:1.孕期炎症可放大MCAO/R致子代大鼠脑损伤。2.孕期炎症子代大鼠MCAO/R脑组织存在COX-2-PGD2-DPs通路失衡、氧化应激和炎症反应增强,进而促进了神经元的凋亡。第二部分COX-2干预对OGD/R致孕期炎症子代大鼠原代神经元损伤的作用观察目的:观察孕期炎症对子代大鼠原代培养神经元OGD/R损伤的影响;采用COX-2抑制剂干预,初步明确COX-2-PGD2-DPs途径在OGD/R处理的孕期炎症子代大鼠原代神经元的变化特征。方法:1.OGD/R致孕期炎症子代大鼠原代培养神经元模型建立:随机选取孕期炎症造模成功的孕鼠,孕鼠妊娠后提取子鼠原代神经元培养至第7天,采用免疫荧光鉴定其纯度,采用三气培养箱处理原代神经元,确定OGD/R致孕期炎症子代大鼠原代神经元损伤的处理时间。2.COX-2抑制剂塞来昔布对OGD/R致孕期炎症子代大鼠原代神经元损伤的作用观察:（1）不同浓度celecoxib作用于OGD/R致孕期炎症子代大鼠原代神经元,CCK-8法测定细胞存活率,生化试剂盒测定LDH漏出率,确定celecoxib对OGD/R致孕期炎症子代大鼠原代神经元损伤的保护作用。（2）根据确定的celecoxib对OGD/R致孕期炎症子代大鼠原代神经元损伤的保护作用的合适浓度,观察COX-2-PGD2-DPs途径在OGD/R处理的孕期炎症子代大鼠原代神经元的变化特征。实验分组为:N+N组、LPS+N组、N+OGD/R组、LPS+OGD/R组、LPS+N+celecoxib组、N+OGD/R+celecoxib组、LPS+OGD/R+celecoxib组。观察指标为:CCK-8法测定细胞存活率,生化试剂盒测定LDH漏出率,流式细胞术和TUNEL法观察OGD/R神经元的死亡情况,生化酶学测定SOD和MDA的水平,ELISA测定IL-1β、IL-6、TNF-α以及PGD2含量;Western blotting测定神经元COX-2、DP1/2、caspase-3、cleaved caspase-3、caspase-9以及Bcl-2蛋白表达。结果:1.培养至7天的原代神经元聚集成团,立体感强,胞体呈椭圆形或锥体形,突起相互交织成稠密的网状结构;原代神经元纯度鉴定超过97%;OGD/R不同的处理时间作用于神经元细胞存活率明显下降（P<0.001）,而LDH漏出率明显增加（P<0.001）,为了神经元损伤合适比例,我们选择糖氧剥夺2h复糖复氧24h作为OGD/R致孕期炎症子代大鼠原代神经元损伤模型建立的条件。2.COX-2抑制剂塞来昔布对OGD/R致孕期炎症子代大鼠原代神经元损伤的作用观察:（1）与N+N组相比,LPS+N组和N+OGD/R组神经元存活率明显降低,LDH漏出率增加（P<0.001&P<0.01）;分别与LPS+N组和N+OGD/R组相比,LPS+OGD/R组经元存活率明显降低,LDH漏出率增加（P<0.001）;给予celecoxib后,与LPS+N组相比,LPS+N+celecoxib组的神经元存活率明显增高（P<0.01）,LDH漏出率降低（P<0.01）;与N+OGD/R组相比,N+OGD/R+celecoxib组的神经元存活率明显增高（P<0.05）,LDH漏出率降低（P<0.001）;与LPS+OGD/R组相比,celecoxib能够显著提高LPS+OGD/R+celecoxib组的神经元存活率（P<0.05）,降低LDH漏出率（P<0.001）。（2）与N+N组相比,LPS+N组和N+OGD/R组凋亡细胞数明显增多（P<0.001&P<0.05）;分别与LPS+N组和N+OGD/R组相比,LPS+OGD/R组凋亡细胞数明显增多（P<0.001&P<0.01）;给予celecoxib后,与N+OGD/R组相比,N+OGD/R+celecoxib组凋亡细胞数明显降低（P<0.05）;与LPS+OGD/R组相比,celecoxib能够显著减少LPS+OGD/R+celecoxib组凋亡细胞数（P<0.01）。（3）与N+N组相比,LPS+N组和N+OGD/R组神经元SOD活性明显降低（P<0.001）,MDA含量明显增加（P<0.001&P<0.05）,TNF-α、IL-6、IL-1β及PGD2含量明显升高（P<0.001）;分别与LPS+N组和N+OGD/R组相比,LPS+OGD/R组神经元SOD活性明显降低（P<0.001&P<0.05）,MDA含量明显增加（P<0.001&P<0.01）,TNF-α、IL-6、IL-1β及PGD2含量明显升高（P<0.001&P<0.01&P<0.05）;给予celecoxib后,与LPS+N组相比,LPS+N+celecoxib组SOD活性明显升高（P<0.05）,MDA含量明显降低（P<0.01）,TNF-α、IL-6、IL-1β及PGD2的含量明显降低（P<0.01&P<0.05）;与N+OGD/R组相比,N+OGD/R+celecoxib组SOD活性明显升高（P<0.001）,MDA含量明显降低（P<0.001）,TNF-α、IL-6、IL-1β及PGD2含量明显降低（P<0.05）;与LPS+OGD/R组相比,celecoxib能够使LPS+OGD/R+celecoxib组SOD活性明显升高（P<0.001）,MDA含量明显降低（P<0.001）,TNF-α、IL-6、IL-1β及PGD2含量明显降低（P<0.001）。（4）与N+N组相比,LPS+N组和N+OGD/R组神经元COX-2、DP1/2、caspase-9、caspase-3及cleaved caspase-3蛋白表达均明显升高（P<0.001&P<0.01&P<0.05）,而Bcl-2蛋白表达减少（P<0.001）;分别与LPS+N组和N+OGD/R组相比,LPS+OGD/R组神经元COX-2、DP1/2、caspase-9、caspase-3及cleaved caspase-3蛋白表达均明显升高（P<0.001&P<0.01&P<0.05）,而Bcl-2蛋白表达减少（P<0.001）;给予celecoxib后,与LPS+N组相比,LPS+N+celecoxib组神经元COX-2、DP1/2、caspase-9、caspase-3及cleaved caspase-3蛋白表达均明显减少（P<0.01）,而Bcl-2蛋白表达升高（P<0.01）;与N+OGD/R组相比,N+OGD/R+celecoxib组神经元COX-2、DP1/2、caspase-9、caspase-3及cleaved caspase-3蛋白表达均明显减少（P<0.05）,而Bcl-2蛋白表达升高（P<0.05）;与LPS+OGD/R组相比,celecoxib能够显著降低LPS+OGD/R+celecoxib组神经元COX-2、DP1/2、caspase-9、caspase-3及cleaved caspase-3蛋白表达（P<0.05）,而Bcl-2蛋白表达升高（P<0.01）。结论:1.糖氧剥夺2h后复糖复氧24h作用于原代神经元可以成功建立OGD/R致孕期炎症子代大鼠原代神经元损伤模型。2.孕期炎症增加子代大鼠原代神经元对OGD/R损伤的易感性;OGD/R处理的孕期炎症子代大鼠原代神经元SOD活性明显降低,MDA、TNF-α、IL-6、IL-1β及PGD2含量明显升高;COX-2、DP1/2、caspase-3、cleaved caspase-3及caspase-9蛋白表达明显升高,Bcl-2蛋白表达减少。3.COX-2抑制剂塞来昔布能够明显改善OGD/R致孕期炎症子代大鼠原代神经元损伤,其机制可能涉及抑制COX-2,减少PGD2生成,下调DP1/2、caspase-3、cleaved caspase-3和caspase-9蛋白表达,上调Bcl-2蛋白表达。第三部分DP1/2干预对OGD/R致孕期炎症子代大鼠原代神经元损伤的作用观察目的:采用DP1/2激动剂和抑制剂进行干预,观察其对OGD/R致孕期炎症子代大鼠原代神经元损伤的影响。方法:（1）不同浓度DP1（BW245C）、DP2激动剂（DK-PGD2）以及DP1（BWA868C）、DP2拮抗剂（AZD1981）作用于OGD/R致孕期炎症子代大鼠原代神经元,CCK-8法测定细胞存活率,生化试剂盒测定LDH漏出率,确定DP1/2激动剂和抑制剂对OGD/R致孕期炎症子代大鼠原代神经元的作用。（2）根据确定的DP1/2激动剂和抑制剂对OGD/R致孕期炎症子代大鼠原代神经元损伤的保护/损伤作用的合适浓度,观察DP1/2干预对OGD/R致孕期炎症子代大鼠原代神经元的作用。实验分组:N+N组、LPS+N组、N+OGD/R组、LPS+OGD/R组、LPS+N+干预组、N+OGD/R+干预组、LPS+OGD/R+干预组。观察指标为:CCK-8法测定细胞存活率,生化试剂盒测定LDH漏出率,流式细胞术观察神经元的死亡情况。结果:与N+N组相比,LPS+N组和N+OGD/R组神经元存活率明显降低,LDH漏出率增加（P<0.001&P<0.01）;分别与LPS+N组和N+OGD/R组相比,LPS+OGD/R组经元存活率明显降低,LDH漏出率增加（P<0.001）;给予药物干预后,分别与LPS+N组、N+OGD/R组和LPS+OGD/R组相比,DP1激动剂BW245C干预组的神经元存活率明显增高,LDH漏出率明显降低,神经元凋亡数目明显减少;DP1抑制剂BWA868C干预组的神经元存活率明显降低,LDH漏出率明显升高,神经元凋亡数目明显增多;DP2激动剂DK-PGD2干预组的神经元存活率明显降低,LDH漏出率明显升高,神经元凋亡数目明显增多;DP2抑制剂AZD1981干预组的神经元存活率明显降增高,LDH漏出率明显降低,神经元凋亡数目明显减少。结论:1.激动DP1能够明显改善OGD/R处理的孕期炎症子代大鼠原代神经元损伤,抑制DP1能够明显加重OGD/R处理的孕期炎症子代大鼠原代神经元损伤。2.激动DP2能够明显加重OGD/R处理的孕期炎症子代大鼠原代神经元损伤,抑制DP2能够明显改善OGD/R处理的孕期炎症子代大鼠原代神经元损伤。