目的：　　 通过研究大肠杆菌中的铁硫蛋白的含量,从大肠杆菌基因组未知功能基因选出筛选一些基因,以分子克隆技术和方法构建这些基因的原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达后,纯化得到基因的编码蛋白,通过测定蛋白的全波长吸收光谱和铁硫含量来鉴定其是否为铁硫蛋白。为铁硫簇蛋白的合成机制和铁硫簇蛋白功能的研究提供基础数据。　　 方法：　　 1.未知功能蛋白基因的克隆及表达载体的构建　　 (1)从大肠杆菌基因组中筛选未知功能基因以GenBank和Eeogene这两个数据库发布的大肠杆菌基因组信息为依据,以目前功能未知、编码氨基酸链少于300个氨基酸、且不连续的半胱氨酸残基数不少于3个为条件,从大肠杆菌基因组中逐一筛选,符合条件的约320个基因,再以这些基因的核酸序列和编码氨基酸序列在NCBI中做基因和蛋白序列比对,参照对比结果,随机挑选出28个基因,即其编码蛋白为待鉴定蛋白。　　 (2)未知功能蛋白基因的克隆及其表达载体的构建根据这28个基因的基因序列,以Primer5.0和DNAMAN软件为工具结合NCBI的比对结果设计各基因的特异性PCR扩增引物,每个基因的的两条引物中上游引物含有NcoⅠ/NdeⅠ限制性内切酶酶切位点,下游引物含有.HindⅢ酶切位点。用高保真PCR扩增出这些未知功能基因,PCR产物经限制性内切酶NcoⅠ/NdeⅠ和HindⅢ酶切后克隆入表达载体pET28b(+),构建重组表达载体。将重组质粒转化入BL21表达菌株中,经抗生素筛选,双酶切和测序鉴定筛选各蛋白的表达菌。　　 2.未知功能蛋白铁硫簇及铁和硫含量测定　　 (1)未知功能蛋白的诱导表达和纯化各未知功能蛋白的表达菌株用IPTG过夜诱导后,收获的菌体经压力破碎后高速离心取上清,带有His-Tag标签的目的蛋白均借助Ni柱进行亲和纯化。纯化流程是:首先经DNA酶处理后的蛋白上清液上样使目的蛋白结合于Ni柱；再用含低浓度咪唑的缓冲溶液洗脱去除杂蛋白；然后用含有高浓度咪唑的缓冲液洗脱收集得到带有6×His-tag的目的蛋白,最后用脱盐柱去除蛋白样中的咪唑。蛋白纯化样品经SDS-PAGE电泳后用考马斯亮蓝染色鉴定蛋白样品纯度。　　 (2)未知功能蛋白的Uv-visble speotrum和铁与硫含量的测定纯化得到的未知功能蛋白样品,用菲咯嗪试剂测定其铁含量,以铁硫蛋白Nth为标准品测定其硫含量,使用Du800蛋白核算分析仪测定其250-700 nm的Uv-visble spectrum。　　 3.铁结合蛋白YrdD活性及功能研究　　 (1)铁结合蛋白YrdD的铁与锌结合力的测定在含有不同浓度的硫酸锌和硫酸铵亚铁的LB培养基中诱导表达蛋白YrdD,测定不同条件诱导后纯化的蛋白YrdD的铁和锌含量,同时体外测定不同浓度的硫酸锌作用后蛋白YrdD的铁和锌含量。　　 (2)测定yrdD基因敲除后对大肠杆菌生长的影响。　　 结果：　　 1.未知功能蛋白基因的克隆及表达载体的构建　　 PCR成功扩增出28个未知功能蛋白的编码基因片段,构建好这些基因的原核表达载体,并转化到感受态BL21菌株中,经抗生素筛选,表达载体双酶切和测序鉴定筛选得到这28个蛋白的原核表达菌株,并冻存待用。　　 2.未知功能蛋白铁硫簇及铁硫含量测定　　 SDS-PAGE电泳鉴定结果显示我们成功诱导、表达并纯化得到蛋白样品纯度大于95％的未知功能蛋白17个。并且根据这些蛋白的Uv-visble speotrum以及铁和硫的含量,我们确定纯化得到的17个蛋白中有9个铁硫簇蛋白和一个单铁结合蛋白。筛选出的铁硫蛋白分别是YfgJ、YsaA、YibA、YqjI、YqeH、YrbL、YadK、YhbV和YjjW,单铁结合蛋白为YrdD。　　 3.单个铁结合蛋白YrdD的活性和功能研究　　 我们测定不同浓度氯化锌和硫酸铵亚铁条件下诱导后纯化得到的蛋白YrdD的铁和锌含量,从中发现蛋白YrdD与铁和锌的结合性竞争关系。成功地从野生型大肠杆菌MC4100基因组中敲除基因yrdD,yrdD敲除后大肠杆菌生长明显受抑制,但是诱导表达蛋白YrdD没有能恢复敲除基因yrdD对大肠杆菌生长的影响。　　 结论：　　 从大肠杆菌28个未知功能蛋白中筛选出9个铁硫蛋白,以及一个单铁结合蛋白,且其与铁和锌的结合性存在着竞争性关系。此实验为探究大肠杆菌中的铁硫蛋白的数量和功能研究提供了一定的基础数据。