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肾细胞癌（RCC）是最常见的癌症之一,约占所有恶性肿瘤的3-5%。在美国,RCC的发病率持续增加,部分原因是肥胖,高血压,吸烟和暴露于其他危险因素的发生率高,另外由于影像学的应用不断增加,肿瘤的检测也得到了改善。据统计,2017年美国估计有63,990例新的RCC病例和14,400例与RCC相关的死亡病例发生。目前外科手术仍是RCC的主要治疗方法,但是存在大约20-40%的患者可能在肾切除术后复发或转移。由于复发或远处转移,晚期RCC患者的5年生存率极低（5-10%）。RCC对放疗和化疗不敏感,因此包括索拉非尼,舒尼替尼和抗血管生成的多酪氨酸激酶抑制剂依维莫司和西罗莫司在内的靶向治疗,已被开发并广泛用作一线和二线治疗。然而,它们对改善患者生存率的影响仍然有限。肿瘤发生和发展是受基因表达变化影响的多步过程,因此,研究肾细胞癌中发生的基因表达变化对改善RCC的诊断,治疗和预防有十分重要的作用。含有 SET（Suppressor of variegation,Enhancer of Zeste,Trithorax）和MYND（myeloid-Nervy-DEAF-1）结构蛋白3（SMYD3）最近由于在各种肿瘤中的失调以及在肿瘤发展中的重要作用而备受关注。SMYD3是一种组蛋白甲基转移酶（Histone lysine methyltransferases,KMTs）,它包含一个 SET 结构域,并具有组蛋白H3-K4二/三和H4-K5-甲基转移酶的活性。它在其下游靶基因的启动子区域识别并占据了5’-CCCTCC-3’的DNA结合基序,并使H3-K4二甲基/三甲基化,从而导致转录激活。在许多类型的正常人体组织中,SMYD3的表达无法检测或非常弱,而研究发现SMYD3的过表达与结直肠癌、肝细胞癌和乳腺癌等多种肿瘤的发生和发展有关。指导教师刘承教授在2007年以前已经对SMYD3开展相关研究,其研究发现端粒酶逆转录酶（hTERT）基因是组蛋白甲基转移酶SMYD3的直接靶标,而后课题组相继发现SMYD3通过刺激雄激素受体转录而成为前列腺癌的致癌驱动因子以及SMYD3通过IGF-1R/AKT/E2F-1阳性反馈回路促进膀胱癌的肿瘤的进展,因此对于SMYD3基因具有一定的认识以及科研积累。基于SMYD3在癌症中的重要作用,以及对SMYD3的不断研究从而取得的新认识,使课题组对SMYD3是否在肾癌细胞中发挥作用产生浓厚兴趣,遂逐步对SMYD3在肾癌中的作用展开研究。在这项研究中,我们确定了 SMYD3通过在转录水平直接激活EGFR促进了 RCC的增殖。使用实时PCR,免疫印迹及免疫组织化学等研究方法,我们发现肾细胞癌组织中的SMYD3表达与非肿瘤组织相比明显升高。而SMYD3的耗竭抑制RCC细胞增殖、集落形成和异种移植肿瘤的形成,但是增加细胞凋亡。通过染色质免疫沉淀和荧光素酶报告基因分析,在表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）启动子区域鉴定出两个功能性SMYD3结合基序。此外,我们验证了 SMYD3和特异性蛋白1(（specifieity protein 1,Sp1）在EGFR启动子结合位点的结合,从而增加了 RCC细胞中EGFR的转录活性。据我们所知,这是首次证明SMYD3促进RCC恶性进展并介导EGFR表达的表观遗传上调。综上所述,通过我们的研究发现SMYD3在人肾细胞癌组织中的表达上调,并且SMYD3通过直接调节EGFR对RCC具有致瘤作用,而EGFR的过表达和包括RCC在内的各种肿瘤细胞的转移、侵润、较差的预后密切相关。我们的研究结果可以很好的为探索SMYD3在促进肾细胞癌的进展机制,治疗肾癌药物研发和预防肿瘤发生的方法提供理论基础。第一部分SMYD3在肾细胞癌组织中的表达及意义研究目的:研究肾细胞癌（RCC）组织及正常肾组织中SMYD3的表达,研究其表达水平与患者预后的关系,探讨SMYD3在RCC的可能作用。研究方法:采用实时定量逆转录-聚合酶链反应（Real-time Quantitative PCR,qPCR）检测12例肾癌组织和癌旁正常组织中SMYD3的表达水平,并采用蛋白质免疫印迹法（Western Blot）进一步验证SMYD3的表达;对103例肾癌患者术后标本采用免疫组化（IHC）检测SMYD3在肾癌及癌旁组织中的表达差异;根据肾癌Fuhrman核分级及病理分期、患者预后进行统计学分析,研究SMYD3的表达水平与其相关性。研究结果:qPCR分析显示,与正常组织相比,RCC组织中SMYD3表达水平升高,SMYD3蛋白的表达分析得出相似的结果。肾癌Fuhrman核分级3/4级患者100%（4/4）SMYD3表达呈强阳性,Fuhrman核分级1级患者75%（24/32）呈弱阳性,病理分期Ⅲ和Ⅳ分期RCC中SMYD3的表达水平显著高于Ⅰ期RCC,差异具有统计学意义（P<0.05）。Kaplan-Meir生存曲线分析发现SMYD3表达较高的肾细胞癌患者生存率较低,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:RCC组织中SMYD3的表达明显升高,表明SMYD3在肾癌中可能起到促癌基因的作用。随着肿瘤分期的增加,SMYD3高表达的比例越高,SMYD3高表达组患者预后不佳,SMYD3高表达可能是患者预后不佳的标志物。第二部分SMYD3在肾癌细胞中的功能研究研究目的:通过研究SMYD3对RCC细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响,验证SMYD3在肾癌细胞中的功能。研究方法:用sh-SMYD3或对照shRNA转染4株RCC细胞,以获得抑制SMYD3蛋白在RCC细胞中表达的细胞。使用CCK-8法研究SMYD3的表达对RCC细胞增殖的影响,使用流式细胞仪分析转染细胞中的细胞凋亡和细胞周期分布。建立裸鼠RCC异种移植模型,研究SMYD3对肿瘤生长的影响。研究结果:成功建立sh-SMYD3转染的细胞,SMYD3表达的降低显着抑制了RCC细胞的生长（P<0.05）;与对照组相比,在sh-SMYD3转染的细胞中发现更多的凋亡细胞,差异具有统计学意义（P<0.05）;但没有证据表明SMYD3的下调会诱导RCC细胞中的G1细胞周期停滞。裸鼠RCC异种移植模型中,sh-SMYD3的小鼠种植肿瘤大小较对照组明显减小,差异具有统计学意义（P<0.05）。结论:下调SMYD3在肾癌中的表达可明显抑制肾癌细胞的增殖能力,并增加细胞凋亡,但并不能证明可诱导G1细胞周期停滞。体外实验进一步证明SMYD3的下调抑制肾癌细胞的增长。第三部分SMYD3通过EGFR调节RCC机制的研究研究目的:探究SMYD3介导RCC细胞效应的分子机制,探索其靶向调控作用。研究方法:基因表达微阵列分析出与SMYD3关联的基因,采用qPCR和Western blot及双荧光素酶报告法分析A498、KRC/Y和786-0细胞株中SMYD3对EGFR转录和表达水平的影响;采用基因芯片法检测EGFR启动子处H3-K4单/二/三甲基化的状态,以确定SMYD3对EGFR表达的影响。通过双荧光素酶报告分析及基因芯片技术研究SMYD3表达的缺失对H3乙酰化和表皮生长因子受体启动子区Sp1占有率的影响,进一步探讨SMYD3通过EGFR调控肾癌细胞发展的机制。研究结果:基因表达微阵列分析发现EGFR在SMYD3缺失的RCC细胞中表达受到抑制;SMYD3的表达抑制导致EGFR mRNA和蛋白质丰度显著降低;双荧光素酶报告分析发现SMYD3对荧光素酶结构的活性具有正向调节作用。EGFR基因转录起始位点上游识别了四个假定的SMYD3结合元件。相应地,MT3或MT4的突变使A498和KRC/Y细胞的EGFR启动子反式激活被阻断。芯片法检测分析发现在EGFR启动子区H3-K4的二甲基化/三甲基化需要SMYD3,且SMYD3的缺失导致肾癌细胞EGFR启动子处组蛋白H3和Sp1结合乙酰化减少。结论:EGFR具有SMYD3的结合位点,并正向调节EGFR的表达。研究发现SMYD3缺失导致肾癌细胞EGFR启动子处组蛋白H3和Sp1结合乙酰化减少,导致EGFR启动子区H3-K4的二甲基化/三甲基化水平降低,从而引起EGFR的转录和表达水平降低,抑制肾肿瘤进展。