本实验室先前的研究表明,利用酿酒酵母MF-α信号肽和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）及人源金属硫蛋白（MT3）编码序列构建融合基因,在转基因植物中表达重组蛋白MF-α-EGFP-MT3,MF-α可介导EGFP-MT3分泌到植物体外,增加转基因植物对部分重金属的抗性。植物和动物的金属硫蛋白结构不同,水稻拥有庞大的金属硫蛋白基因家族（编码11种金属硫蛋白,OsMTs）,海篷子（Salicornia europaea L.）有耐盐碱、耐金属的超强能力,因此本研究论文尝试利用MF-α的介导作用在转基因植物中过量表达分泌型水稻金属硫蛋白基因OsMT-I-2b和海篷子金属硫蛋白基因SbMT-2。为了便于表达蛋白的检测,将这两个蛋白基因的编码区与报告基因EGFP融合表达,通过生物公司合成SbMT2和OsMT2与EGFP融合基因序列:EGFP-SbMT2和EGFP-OsMT2,利用Gateway技术构建两个含有α因子信号肽（MF-α）的植物表达载体pK-MF-α-EGFP-SbMT2和pK-MF-α-EGFP-OsMT2,转化烟草和天竺葵,获得相应的转基因株系,考察转基因株系对重金属的富集能力和抗性,进而分析过量分泌型金属硫蛋白的作用机理,获得如下研究结果:1、选取基因组PCR检测成功的转基因烟草植株,进行转基因转录水平和蛋白表达水平的检测,结果在转基因植株叶中证实有SbMT2和OsMT2的转录,根、茎及叶片中有EGFP-SbMT2和EGFP-OsMT2融合蛋白的表达。用Cd²⁺处理转基因植株根系,分析结果说明转基因植物中积累更多的Cd²⁺,且地上部大于地下部,分泌型金属硫蛋白的表达水平与转基因植物体内不同组织中Cd²⁺的积累量具有较好的相关性。收集根系处理液及叶片表面水洗液,电化学分析表明转基因根系处理液和叶片表面水洗液中均有EGFP-SbMT2、EGFP-OsMT2蛋白及Cd²⁺,说明MF-α成功介导金属硫蛋白从根和叶片组织内向外分泌,分泌的金属硫蛋白同时结合Cd²⁺。通过激光共聚焦扫描显微镜对表达蛋白进行亚细胞定位分析,结果发现转基因植物根毛、叶毛里有GFP荧光,此外在茎和叶脉皮层薄壁细胞的质外体空间也发现GFP荧光,这证实过量表达的EGFP-SbMT2和EGFP-OsMT2蛋白通过叶毛、根毛分泌到植物体外,另一部分会分泌至皮层薄壁细胞的质外体空间。2、用Cd²⁺（100μmol/L）、Pb²⁺（15 mg/L）、Cu²⁺（500μmol/L）分别处理WT和SbMT2、OsMT2转基因烟草植株的根系,考察分泌型金属硫蛋白的过量表达是否可以增强转基因植物对其他重金属的富集和吸收能力。处理一周后发现三种重金属处理的SbMT2、OsMT2转基因烟草植株的生长状况均比WT好,表明分泌型金属硫蛋白基因SbMT2、OsMT2的过量表达可以增强转基因植物对多种重金属的抗性。电化学分析三种重金属的吸收量,结果说明OsMT2转基因烟草植株吸收的Pb²⁺大于SbMT2植株,而SbMT2转基因植物对Cd²⁺和Cu²⁺的吸收效果较好,说明不同的金属硫蛋白对不同重金属离子的结合能力不同,从而使转基因植株对不同重金属具有不同的吸收能力。利用PI和FDA的复合染色分析根尖细胞凋亡情况,结果表明WT植株在Cu²⁺处理后根尖死亡细胞比SbMT2植株多,转基因SbMT2植物根尖的根冠和分生区死亡细胞虽较多,但在根尖伸长区的死亡细胞明显比WT植株要少,这证实分泌型金属硫蛋白基因SbMT2、OsMT2的过量表达可以增强植物对重金属引起根尖细胞凋亡的抗性。3、为了研究分泌型金属硫蛋白的过量表达增强转基因植物对重金属的富集和吸收机理,分别用Cd²⁺、Pb²⁺、Cu²⁺处理WT、MT3、SbMT2、OsMT2转基因烟草植株的根系,7天后分析光合相关指标的变化,结果说明Cd²⁺处理三种转基因植株的净光合速率（Pn）、蒸腾速率（E）、气孔导度（C1）及细胞间隙CO₂浓度（CO₂int）均显著高于WT植株,转基因植株的Pn达到WT的1.5²倍,而SbMT2的蒸腾速率（E）为0.2 mmol/m²·s,达到WT的4倍。Pb²⁺处理烟草一周后,转基因植株的Pn、CO₂int均比WT植株高,但是C1和CO₂int都显著低于WT。Cu²⁺处理后三种转基因植株的Pn、E、C1及CO₂int变化与Cd²⁺处理的相似,均显著高于WT植株。收集根茎叶测定不同组织内丙二醛（MDA）和H₂O₂含量,结果说明转基因植株不同组织中MDA的含量均比WT低2³倍,转基因植株叶片中H₂O₂含量也显著低于WT植株。分析不同抗氧化物酶活性的变化,结果说明Cd²⁺、Pb²⁺、Cu²⁺处理后,转基因植株的POD、SOD、APX及CAT活性均大幅度高于WT植株,SOD、APX及CAT的增加幅度尤为显著。这些结果表明,植物吸收Cd²⁺、Pb²⁺、Cu²⁺在不同组织中富集,导致细胞内产生大量的H₂O₂、MDA等有害物质,影响气孔的导度,净光合速率和蒸腾作用,产生氧化胁迫和氧化损伤,致使叶片萎黄,茎变黑,根尖细胞死亡。而分泌型金属硫蛋白的过量表达可以通过调控POD、SOD、APX及CAT活性,及时清除Cd²⁺、Pb²⁺、Cu²⁺等重金属积累产生的活性氧,改善转基因植株的光合特性,从而显著增加转基因植物对重金属富集能力和抗性。