研究背景:肾脏肿瘤是泌尿系统中最常见的恶性肿瘤之一,对常规的放疗及化疗不敏感。研究表明肾癌干细胞在肾脏肿瘤生长、进展、复发过程中发挥重要作用,因此针对肿瘤干细胞研究可探索有效治疗肾脏肿瘤途径。染料木黄酮(genistein)是存在豆科植物生物中的一类酮类复合物,具有预防心血管疾病、抗肿瘤以及植物雌激素活性。染料木黄酮在多种肿瘤中发挥抗癌作用,其中包括乳腺癌、直肠癌以及卵巢癌。然而,染料木黄酮对于肾癌干细胞的相关影响还未曾被相关研究人员探索。研究目的:在本研究中,利用体外无血清培养技术从肾癌肿瘤786-O和ACHN细胞系中富集分离肾癌干细胞。探索染料木黄酮对肾癌干细胞是否有影响,并进一步研究Shh通路在其中所发挥的作用。研究方法:在本实验中,我们首先利用体外无血清培养技术从786-O和ACHN两种肾癌细胞系分离富集形成三维立体的细胞球的肾癌干细胞,然后利用免疫蛋白印记和荧光定量PCR技术检测相关干细胞标志物包括CD133、CD44、ALDH1A1、Oct-4、Nanog的表达水平,为进一步验证肾癌悬浮细胞球干细胞特性,应用流式细胞仪检测贴壁细胞和悬浮细胞的细胞周期分布。随后利用梯度浓度(0,30,60,90μM)的染料木黄酮和(或)1μM Purmorphamine分别处理这些肾癌干细胞球5天。应用免疫蛋白印记和荧光定量PCR技术检测相关干细胞标志物、SHH信号通路(Shh、Smo、Gli1、Gli2)和增殖凋亡(PCNA、Cyclin-D1、Bcl-2、Bax、cleaved-caspase8,cleaved-caspase 9和cleaved-caspase3)等相关分子的表达水平。利用细胞免疫荧光技术检测786-O细胞球表面干细胞标志物CD44分子的表达情况。研究结果:实验结果表明,与含血清培养的贴壁细胞相比,肿瘤干细胞标志物CD133、CD44、ALDH1-A1、Oct4、Nanog在无血清培养富集分离悬浮细胞球中在m RNA和蛋白质水平上都有高表达。此外,流式细胞仪分析显示悬浮球细胞的处于细胞分裂静止的G0和G1期,而富含血清培养的贴壁细胞则处于分裂旺盛的G2和S期。我们进一步发现染料木黄酮抑制肾癌干细胞球的形成,下调关干细胞标志物、Shh信号通路和增殖相关蛋白分子的的表达;上调促凋亡蛋白分子的表达。此外,研究发现Shh信号通路激活剂Purmorphamine可逆转染料木黄酮对肾癌干细胞活性和Shh信号通路的抑制作用。以上结果表明,染料木黄酮可通过下调Shh信号通路介导对肾癌干细胞活性的抑制作用。