论文部分内容阅读
背景:腹膜透析(PD)是可供终末期肾脏病(ESRD)患者选择的替代治疗方式之一,全球范围内约有11%的ESRD患者接受腹膜透析治疗。随着PD技术的改进,腹膜感染控制的加强,腹透相关的腹膜纤维化成为PD患者退出腹膜透析的主要原因,极大限制了PD的发展和推广。腹膜间皮细胞上皮-间充质转分化(epithelial-mesenchyrnal transition,EMT)是腹膜功能逐渐降低、发生腹膜纤维化的关键环节,并且具有可逆性。因此,逆转EMT对保护腹膜间皮细胞及减轻腹膜纤维化具有重要意义。锌是机体不可或缺的一种微量元素,是矿物元素中参与酶活动最多的一种,同时也是核酸代谢、蛋白质合成、转录因子结构的基础。锌离子代谢的稳态平衡对维持机体正常生理功能至关重要,若其平衡性被打破,势必导致相关联疾病的产生。动物模型和某些临床研究表明,缺锌可能与慢性炎性疾病的纤维化有关,包括肝、心肌和囊性纤维化等。而锌补充可以发挥多种功能,包括抑制纤维化、抗氧化、抗炎和抗凋亡。在一些纤维化动物模型和临床上慢性炎症疾病患者补充锌治疗,可以减轻锌缺乏所引发的病变。锌离子不能自由通过细胞膜,需要在锌转运体的协助下完成。作为锌转运体之一的SLC30A即ZnTs的作用是促使Zn向细胞外释放或进入细胞器内,降低细胞浆内的Zn含量。ZnTs不仅直接参与了细胞的锌离子稳态代谢,同时还通过复杂的机制影响着肿瘤和纤维化等疾病的发生和发展。本课题前期研究发现,高糖腹透液通过促进活性氧(ROS)的生成而诱导大鼠腹膜间皮细胞EMT,而锌补充可以抑制ROS而逆转高糖诱导大鼠腹膜间皮细胞的EMT,且ZnTs在大鼠腹膜间皮细胞上表达丰富,它们对腹膜间皮细胞的代谢及功能的调节起重要作用。但锌在体内及人腹膜间皮细胞(HPMCs)腹透相关的腹膜纤维化模型中的影响及机制目前尚不清楚,ZnTs对高糖诱导HPMCs的EMT的影响及机制仍需进一步探究。目的:本研究旨在观察Zn及ZnTs对高糖诱导腹膜间皮细胞EMT的影响,并进一步探讨其影响机制,为有效抑制EMT、延缓腹膜纤维化提供新的科学依据。研究方法:本研究在既往工作的基础上,通过整体动物实验和体外细胞实验相结合的方法,观察了Zn在高糖诱导腹膜间皮细胞EMT及腹膜纤维化中的作用。从氧化应激和相关通路活化、转运体等不同层面来探讨改善腹膜纤维化的机制。体内实验通过建立大鼠腹膜透析相关的腹膜纤维化模型,检测大鼠腹膜超滤功能及葡萄糖转运量,采用苏木精-伊红(HE)染色法和改良Masson三色染色法观察大鼠腹膜组织纤维化程度,免疫组织化学技术和Western Blot技术检测大鼠腹膜组织E-cadherin、Vimentin和Collagen表达水平。体外细胞实验通过建立人腹膜间皮细胞EMT模型,利用Transwell共培养系统观察HPMCs的迁移功能,应用Western Blot技术、免疫荧光技术检测EMT指标(E-cadherin、Vimentin)的表达变化,应用流式细胞术检测HPMCs活性氧的表达,应用qRT-PCR技术检测HPMCs的ZnTs mRNA表达变化,应用TSQ探针检测HPMCs的Zn的变化,高尔基体红色荧光探针定位其高尔基体,采用脂质体转染法对HPMCs进行转染,应用免疫荧光技术、Western Blot等技术检测Zn及ZnT5对高糖诱导HPMCs的EMT的影响及相关机制。结果:包括体内实验结果和体外实验结果。体内实验结果1、Zn对大鼠腹膜组织形态学影响:HE和MASSON染色结果显示,高糖组腹膜厚度明显增加,间皮下基质疏松,胶原纤维大量沉积,表皮间皮细胞裸露,并伴有炎细胞浸润;锌螯合剂组进一步加重大鼠腹膜上述形态改变;而锌组大鼠腹膜上述形态均明显改善。2、Zn对大鼠腹膜功能的影响:结果显示,高糖组的腹膜超滤功能降低,葡萄糖转运功能增加;锌螯合剂组加剧上述改变;锌组腹膜超滤功能增加,葡萄糖转运功能降低。3、Zn对大鼠腹膜组织EMT的影响:免疫组化分析和Western Blot结果显示,高糖组E-cadherin蛋白表达降低,Vimentin、Collagen蛋白表达增加;锌螯合剂组进一步加剧上述变化;而锌组E-cadherin蛋白表达增加,Vimentin、Collagen蛋白表达减低。体外实验结果1、Zn对高糖刺激人腹膜间皮细胞形态学变化的影响:高糖组可见上皮样细胞和梭形细胞混合存在,锌螯合组可见大量梭形成纤维细胞,高糖组、锌螯合剂组HPMCs形态的改变提示HPMCs发生了EMT改变。锌补充后可部分逆转上述形态学改变。2、Zn对高糖刺激人腹膜间皮细胞迁移功能的影响:高糖组移行至膜下的HPMCs细胞数明显增加,锌螯合剂组HPMCs的细胞数进一步增加,而锌组移行至膜下的HPMCs细胞数明显减少。高糖组、锌螯合剂组HPMCs迁移活性增强,表明HPMCs已具有间充质细胞特性,提示HPMCs发生了EMT。3、Zn对高糖刺激人腹膜间皮细胞EMT的影响:免疫荧光和Western Blot结果显示,高糖组E-cadherin蛋白表达降低,Vimentin表达增加;锌螯合剂组进一步加重上述改变;而锌组E-cadherin蛋白表达增加,Vimentin蛋白表达减低。4、Zn对高糖诱导人腹膜间皮细胞ROS的表达的影响:高糖可增加人腹膜间皮细胞ROS水平,促进氧化应激;锌螯合剂组的ROS水平进一步增加,而锌组ROS水平显著降低。5、Zn对高糖诱导人腹膜间皮细胞的Nrf2信号通路的影响:高糖促进人腹膜间皮细胞核Nrf2、NQO1以及HO-1蛋白表达增加。与高糖组比较,锌螯合剂组核Nrf2、HO-1和NQO1的蛋白表达减少,而锌组促进上述蛋白表达进一步增加,提示锌可能通过激活HPMCs中Nrf2信号通路发挥抗氧化应激的作用。6、高糖对人腹膜间皮细胞ZnTs的影响:qRT-PCR结果显示,正常人腹膜间皮细胞存在ZnTs的表达,高糖刺激HPMCs后ZnT5基因表达明显升高,提示ZnT5可能参与高糖诱导人腹膜间皮细胞的EMT。7、ZnT5基因沉默对高糖诱导HPMCs的ZnT5和锌离子转运的影响:高糖增加ZnT5在mRNA和蛋白表达,介导高尔基体锌离子内流,降低细胞内锌离子浓度,促进HPMCs发生EMT。与高糖组相比,ZnT5基因沉默后,细胞浆内锌离子明显增加。8、ZnT5基因沉默对高糖诱导HPMCs的EMT的影响:Western Blot结果表明,ZnT5-siRNA组可明显增加HPMCs的E-cadherin蛋白表达,降低Vimentin蛋白表达,提示ZnT5-siRNA可逆转HPMCs的EMT。9、ZnT5基因沉默对TGF-β/Smad信号通路的影响:Western Blot结果表明,与高糖组相比,ZnT5-siRNA组TGF-β1、p-Smad2/3表达明显降低,p-Smad7的表达明显增加,提示ZnT5-siRNA通过TGF-β/Smad信号转导通路逆转EMT。结论:1、高糖腹透液可致大鼠腹膜形态及功能发生改变,大鼠腹膜间皮细胞出现转分化。2、锌缺乏进一步加重高糖腹透液所致大鼠腹膜形态及功能改变,促进大鼠腹膜纤维化,而锌补充可部分逆转高糖腹透液所致大鼠腹膜形态及功能改变,阻抑大鼠腹膜纤维化。3、高糖能够诱导人腹膜间皮细胞发生EMT,锌缺乏可促进高糖诱导人腹膜间皮细胞EMT,而锌补充能够部分逆转人腹膜间皮细胞EMT。4、锌抑制高糖诱导人腹膜间皮细胞EMT的机制是:(1)锌可通过抑制氧化应激反应而抑制人腹膜间皮细胞EMT。(2)锌可通过激活Nrf2信号通路而抑制人腹膜间皮细胞EMT。5、人腹膜间皮细胞存在ZnTs的表达,ZnT5与高糖诱导的人腹膜间皮细胞EMT有关。6、ZnT5基因沉默可减轻高糖诱导的人腹膜间皮细胞EMT。7、ZnT5基因沉默通过调控TGF-β/Smad通路逆转高糖诱导的人腹膜间皮细胞EMT。