狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)引起的一种具有极高致死性的人兽共患传染病,能够感染人和温血动物。全球每年因该病死亡的人数在60000人左右。目前该病尚无有效的治疗方法,感染人一旦出现症状,病死率100%。但只要进行有效的暴露后处置,就可100%预防本病的发生。由于犬是本病的重要贮存和传播宿主,针对犬进行免疫可有效预防本病的发生,防止其向人群的传播。业已证明,70%的犬只免疫覆盖率即可有效阻止狂犬病的传播。评价免疫效果及免疫覆盖率的指标是机体内RABV中和抗体的水平。目前针对狂犬病中和抗体测定的方法有多种,国际上认可的金标准方法包括动物体内中和试验和细胞中和试验。由于动物中和试验常采用较多动物,花费周期较长,目前已不多用。细胞中和试验方法有荧光抗体病毒中和试验(Fluorescent antibody virus neutralization,FAVN)和快速荧光灶抑制试验(Rapid fluorescent focus inhibition test,RFFIT)两种。但这两种方法通常需要在2~3个工作日才能完成,并涉及活毒操作,需要专业培训的技术人员,比较适合专业化的实验室使用。由于条件限制,在我国省级以下的基层实验室尚未使用以上两种试验方法开展RABV中和抗体的检测,而是大多采用ELISA的方法,进行抗体检测和免疫覆盖率监测。目前国内外报道的ELISA方法包括间接ELISA、竞争ELISA和阻断ELISA等,这些方法大多采用纯化的或部分纯化的RABV作为包被抗原。由于犬血清成分复杂,假阳性或假阴性结果在这些方法中较为常见。降低假阳性和假阴性背景是目前RABV抗体检测ELISA方法中亟待克服的问题。糖蛋白(glycoprotein,GP)是狂犬病病毒的5种结构蛋白之一,是RABV的关键蛋白。其能够影响病毒的毒力,刺激机体产生保护性病毒中和抗体(viral neutralizing antibody,VN A),诱发机体产生免疫保护反应。因此糖蛋白是检测狂犬病抗体的理想抗原。但该蛋白是一种跨膜蛋白,较难从完整病毒中获得,在重组表达中对表达体系糖基化能力的要求较高。成熟的G蛋白由三个结构域构成:膜外区(ectodomain,ED)、穿膜区(transmembrane,TM)和细胞质区(cytoplasmic domain,CD),其中膜外区是中和抗原表位所在部位。因此,本研究采用哺乳动物表达系统,分泌表达糖蛋白的膜外区部分,并基于此表达产物和本实验室具有的、针对该糖蛋白的中和性单克隆抗体,建立了不依赖于全病毒颗粒作为包被抗原的狂犬病阻断ELISA抗体检测方法,试图降低假阳性和假阴性背景,为狂犬病提供一种可靠的、可供大规模样品免疫监测的手段。现将方法和结果报告如下:1.稳定表达狂犬病病毒糖蛋白膜外区的细胞系的构建:首先获得BD06株RABV的G蛋白膜外区基因片段,与载体pCMV-Sec酶切连接,构建重组质粒;测定HEK293细胞对筛选药物博来霉素(zeocin)的敏感性;将重组质粒转染293细胞,利用筛选药物加压得到阳性克隆;分别利用ELISA和Western Blot方法对阳性克隆表达上清的反应原性进行鉴定;同时,对得到的细胞系连续传代并冻存复苏,检测细胞系的表达稳定性。结果显示,该部分研究成功扩增得到G蛋白膜外区片段G-e1317,并将该片段成功插入表达载体pCMV-Sec,得到重组质粒pCMV-Ge;确定了700μg/ml的zeocin浓度为转染后的最佳药物筛选浓度;重组质粒转染细胞后,得到8个有zeocin抗性的细胞克隆,通过ELISA检测得到5株能够与RABV糖蛋白单抗6F12以及his标签单抗发生反应的细胞株;分别使用RABV糖蛋白单抗和his单抗进行WB,均在60kd左右得到与预期相符的目的条带;细胞系连续传至60代次后表达水平无明显变化,冻存和复苏对细胞系的表达水平也无明显影响,证实筛选得到的细胞系较为稳定。2.RABV阻断ELISA抗体检测体系的建立:利用细胞系表达的RABV G蛋白作为抗原,建立阻断ELISA抗体检测方法,并分别对ELISA体系的各步条件进行优化,包括:抗原包被液的选择、抗原包被时间和温度条件、封闭液的选择、抗原包被浓度与单抗稀释倍数的确定、酶标抗体的选择、血清反应条件的优化、洗液的选择、显色条件的优化以及抗原包被稳定剂的选用等。条件优化后,检测25份阴性血清,根据公式:检测临界PI值=阴性血清PI平均值+2×SD得到该方法的检测临界值;通过对多个血清的重复检测(批间和批内),对方法的重复性进行评价。最终,此部分研究成功确定优化后的ELISA反应体系:37℃表达上清原液包被1.5h,0.05%的PBST洗涤3次后,使用20%的阴性血清于37℃封闭2h;洗涤后,加入待检血清原液,于37℃反应45min;洗涤后,加入1:500倍稀释的6F12酶标抗体,37℃孵育1h;洗去抗体后,加入TMB显色液,于37℃条件下避光显色7min,终止显色,读取数值。加速试验的结果证明,经稳定剂处理的ELISA板在37℃保存14天后,对于不同效价血清的检测结果与当天包被板的检测结果无显著差异(P<0.05),证明稳定剂对包被抗原有较好的保护效果;同时,根据阴性血清的PI值检测结果及临界值计算公式,得到32.1%作为临界PI值;重复性评价结果显示,不同效价的血清样品在批间和批内检测中OD值的变异系数(CV)均在10%以下,证实该方法有较好的重复性。3.RABV阻断ELISA抗体检测方法的应用:分别利用FAVN和优化后的ELISA方法对364份犬血清临床样品进行检测,以FAVN为金标准,根据结果绘制ROC曲线,得到AUC值,计算在32.1%临界值下检测的敏感性和特异性,以及ELISA方法检测结果与金标方法的符合率。同时,利用Youden指数评价得到较优临界值。结果显示,对364份血清样品的检测中,以FAVN为金标准,ELISA方法的检测敏感性为88.9%,特异性为98.6%,与FAVN检测的符合率为92.6%。ROC分析得到的曲线下面积为0.964,证实该方法有很高的诊断价值。同时,根据Youden指数评价结果也显示,32.1%为较优临界值,为ELISA试剂盒产品的开发奠定基础。通过以上研究,得出以下结论:1.本研究成功构建了能够稳定表达狂犬病病毒糖蛋白膜外区的细胞系,并通过ELISA和WB证实蛋白的反应原性,为G蛋白膜外区的应用奠定了基础。2.利用细胞系表达产物和单抗建立了检测血清狂犬抗体的阻断ELISA方法,并实现了对该方法的优化,确立了阻断ELISA最佳反应条件:表达上清原液在37℃条件下包被1.5h;使用20%的阴性血清作为封闭液在37℃封闭2h;待检血清以原液加入,于37℃反应45min;之后加入1:500倍稀释的6F12酶标抗体,37℃孵育1h;以上各步之间均使用0.05%的PBST洗涤3次,最后洗去抗体后,加入TMB显色液,于37℃条件下避光显色7min;终止显色后,读取数值。3.通过对226份阳性犬临床血清样品和138份阴性临床样品的检测,证实该方法与FAVN金标准有较高的符合率(92.6%),为试剂盒产品的开发提供重要数据。通过以上研究可以看出本研究的创新点包括:1.首次利用哺乳动物细胞表达系统实现对RABV糖蛋白膜外区的分泌表达,并通过培养条件摸索,采用其无血清细胞培养基中的表达产物直接应用于阻断ELISA方法中的抗原包被,节省了抗原纯化成本。由于采用了RABV单一成分G蛋白作为包被抗原,减少了病毒颗粒中其他成分的反应背景。2.在国内首次采用糖蛋白的膜外区作为抗原建立了RABV阻断ELISA抗体检测方法,并验证了其与金标方法的一致性,已在实验室组装成试剂盒,为我国狂犬病免疫监测提供了又一种有效的工具和方法,对我国狂犬病大量样本的抗体监测具有实际意义。