应用单个锁核酸修饰的探针提高对非互补杂交识别能力的研究目的DNA双链的完全互补杂交是进行微阵列分析、SNP鉴别、基因表达分析、序列测定、以及其它检测的基础。为了达到检测的准确性,寡核酸探针必须能够特异地识别其靶标DNA或RNA链,从而通过完全互补杂交形成稳定的双链。同时,每个探针必须能够有效地识别那些包含错配、插入或缺失的非互补链从而避免形成非互补的双链。因此,设计的探针应该能够最大程度地提高互补杂交和非互补杂交双链的解链温度的差值,从而在选定的杂交温度下,只有靶标核酸才能与探针结合,而非靶标核酸不能与探针结合。然而,在实际检测中,在同一检测样品溶液中有很多的DNA和RNA样品,它们的核酸序列与正配的靶标仅相差一个或两个碱基,因此,它们的Tm值有可能与正配的Tm值相差仅有0.5℃或更小,这样它们将会干扰靶标和探针形成杂交双链,从而产生假阳性信号。为了提高DNA或RNA链的识别能力和对错配碱基的区分能力,目前已有许多应用寡核苷酸类似物的报道,如硫代磷酸寡核苷酸、2’-O-甲基化寡核苷酸、PNA(肽核酸)、2’-氟代-N3-P5’-亚磷酰胺、5’-anhydrohexitol nucleic acids(HNAs)等,这些核酸类似物形成的杂化双链均具有很好的热稳定性,但均因具有某些缺点而限制了其使用。LNA是一种特殊的双环状核苷酸衍生物,含有一个或多个2’-O,4’-C-亚甲基-B-D-呋喃核糖核酸单体,核糖的2’-O和4’-C位通过不同的缩水作用形成氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥,并连接成环形。这个环形桥锁定了呋喃糖C3-内趋型的N结构,降低了核糖结构的柔韧性,增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性。寡核苷酸中掺入LNA可使Tm值升高,LNA-DNA互补杂交双链的解链温度可升高3-9.6℃。然而,关于LNA修饰的探针如何提高对非互补的DNA或RNA片段的识别的研究却少有报道。在本实验中,我们系统地研究了20-mer和30-mer的杂交双链中错配与插入碱基的化学性质,位置,数目及协同效应对杂交双链稳定性的影响,总结了相关的稳定性趋势;应用温度梯度PCR实验来验证错配双链的不稳定性。研究了LNA修饰的探针对双链稳定性的影响及对非互补核酸链的识别能力。设计了LNA修饰的探针和一组包含不同的错配及插入的DNA寡核酸链作为靶标,系统地研究错配与插入碱基的化学性质,位置,数目及协同效应对LNA-DNA杂交双链稳定性的影响,同时,还应用实时定量PCR实验进一步验证了单个LNA修饰的探针对错配的识别能力。这些结果对设计LNA修饰的探针以进行DNA或RNA检测提供了非常有价值的信息。方法1、大肠杆菌培养从-80℃冰箱中取出冻存的大肠杆菌,用无菌牙签迅速挑出少量菌液放入LB培养基中,用铝箔封好,在37℃振荡培养箱中振荡培养12小时以上。2、大肠杆菌DNA提取取饱和大肠杆菌菌液2ml,用细菌基因组DNA提取试剂盒提取大肠杆菌基因组DNA,作为PCR反应的模板。3、解链温度测定紫外分光光度计测定杂交核酸的解链曲线,软件处理得到解链曲线,利用一阶导数确定杂交双链的解链温度。4、温度梯度PCR实验温度梯度PCR实验验证错配双链的不稳定性。5、实时定量PCR实验应用实时定量PCR实验研究了单个LNA修饰的引物对错配的识别能力。6、普通PCR实验应用普通PCR实验进一步验证单个LNA修饰的引物对错配的识别能力。结果1、单碱基错配对双链热稳定性的影响当杂交双链中含有单碱基错配时,双链变得不稳定,它们的解链曲线与完全互补的双链相比发生了向左偏移,这表明它们的解链温度明显降低。2、双碱基错配对双链热稳定性的影响两对碱基错配可使双链的的解链曲线进一步左移,说明解链温度发生了进一步的下降。双碱基错配的不稳定性还表现在解链范围的增大。3、错配位点对双链热稳定性的影响随着错配位置由边缘向中心的趋近,解链温度逐步下降,并在中心点上表现出了最大的影响效应。表明错配发生在核酸片段中心部位时,错配的碱基将其分割为两个较短的核酸片段,能够最大限度地破坏杂交双链的稳定性。4、插入对双链热稳定性的影响同错配一样,碱基插入同样会破坏双链的稳定性,两个或三个碱基的插入要比单碱基插入和单碱基错配更不稳定。5、温度梯度PCR实验结果在温度梯度PCR扩增实验中,引物能够与模板实现完全互补杂交、单碱基错配杂交及双碱基错配杂交。但是随着杂交温度的升高,与模板有两个碱基发生错配的双碱基错配引物扩增效率<单碱基错配杂交<完全互补杂交。6、LNA提高双链稳定性的作用当杂交双链中包含有完全互补的LNA:DNA碱基对A:t,a:T,G:c或g:C时,它们的解链温度与相应的DNA-DNA双链相比提高了4.2-5.0℃。当LNA-DNA双链中包含有两对LNA:DNA碱基对如C:g+t:A或c:G+T:a,它们的解链温度分别增高了7.7℃和7.1℃。当探针和靶标中各含有一个LNA碱基并可形成含有LNA:LNA碱基对A:T或G:C的完全互补的杂交双链时,杂交双链的解链温度与相应的DNA-DNA双链相比分别提高了6.5℃和8.0℃。说明在一对碱基对中LNA无论修饰哪个碱基,其作用都是相近的。这些结果显示,LNA修饰的探针可以提高杂交双链的稳定性。7、LNA:DNA错配碱基对的热稳定性LNA:DNA错配对双链稳定性的破坏作用要大于DNA:DNA错配。其中C:c和C:t错配是所有LNA:DNA错配中最不稳定的碱基对,而c:c和c:t错配是所有DNA:DNA错配中最不稳定的碱基对,T:g和t:g对双链稳定性破坏的作用是最小的。并且N:m错配和n:M错配对双链稳定性破坏的作用有很大的不同。8、含有一个LNA:DNA互补碱基对和一个DNA:DNA错配碱基对的双链的热稳定性随着错配位点逐渐靠近双链的末端,错配对双链稳定性的破坏作用逐渐减弱;另外,双链稳定性主要取决于错配碱基对的类型,而与错配距LNA:DNA互补碱基对的距离无明显关系。9、靶标链上发生单碱基插入时LNA-DNA双链的稳定性若对杂交双链进行单个碱基的LNA修饰,当双链发生单碱基插入时,插入对LNA-DNA双链稳定性的破坏作用要大于DNA-DNA双链,说明LNA碱基对插入的识别能力高于DNA碱基。LNA碱基修饰鸟嘌呤比修饰胞嘧啶时,对插入的识别能力更强。10、实时定量PCR实验结果PCR上游引物的3’末端经LNA修饰后,若3’末端与模板不是互补的,则PCR扩增效率明显降低,即LNA修饰的引物其识别错配的能力与DNA引物相比大大提高。普通PCR实验也证明LNA引物可产生较少的错配产物,而DNA引物与模板发生错配时却有大量的错误产物扩增出。结论1、不同类型的碱基错配其稳定性各不相同,其顺序为:G:T>G:G>G:A>A:A>或≈T:T>或≈A:C>T:C>C:C。2、碱基错配发生在中间比发生在两端对双链的稳定性具有更大的破坏效应。3、碱基插入与碱基错配对双链稳定性的破坏作用相似。4、LNA修饰的寡核酸探针不仅可显著提高杂交双链稳定性,还可以提高双链特异性。5、LNA修饰嘌呤碱基时,其识别错配的能力高于DNA碱基和LNA修饰嘧啶碱基。6、随着错配位点逐渐靠近双链的末端,错配对双链稳定性的破坏作用逐渐减弱;另外,双链稳定性主要取决于错配碱基对的类型,而与错配距LNA:DNA互补碱基对的距离无明显关系。7、LNA碱基对插入的识别能力高于DNA碱基;LNA碱基修饰鸟嘌呤比修饰胞嘧啶时,对插入的识别能力更强。8、PCR引物的3’末端经LNA修饰后,其识别错配的能力与DNA引物相比大大提高。