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胸主动脉瘤（Thoracic aortic aneurysm,TAA）是胸主动脉壁的一种退行性疾病,它起病隐匿,往往在发生夹层和破裂的时候才被发现,死亡率很高。目前临床上尚无特效药,仅仅通过开放手术或血管内技术进行修复。TAA进展的自然史仍然不能改变。因此,越来越多的研究旨在了解TAA发展的潜在事件,并开发新的治疗策略来改变TAA的病程。在过去的二十年里,研究人员已逐步了解动脉瘤形成的分子机制。目前认为TAA可由基因突变引起,如Fibrillin-1引起的马凡综合征;也可以在没有任何综合征的情况下以常染色体显性遗传的方式遗传;此外,还有一些不明原因的散发病例。但不论是综合征性TAA、家族遗传性TAA还是散发的TAA,他们的主动脉都存在着炎症浸润,且以T细胞和巨噬细胞为主。这提示我们,主动脉炎症在TAA的发展过程中发挥关键作用。炎症是免疫系统反应中的一个重要组成部分。先天性免疫和适应性免疫在动脉瘤的起始和发展过程中作用重要,二者密不可分。Toll样受体（Toll like receptors,TLRs）是一种经典的模式识别受体,在先天性免疫和适应性免疫中发挥重要的功能。近年来,越来越多的学者关注到它们与心血管疾病的联系,如动脉粥样硬化、缺血再灌注损伤。一些TLRs被证实在腹主动脉瘤（Abdominal aortic aneurysm,AAA）中发挥致病作用,如TLR2、TLR4。但TLRs在TAA中的作用鲜有报道。我们通过Nano String数字化基因检测技术分析血管平滑肌（Smooth muscle cell,SMC）Tgfbr1敲除TAA模型小鼠(Tgfbr1sm-ko)主动脉炎症基因表达改变时发现TLR7的表达增高,提示着我们TLR7与TAA存在着某种联系。TLR7是一种经典的TLRs,它通过识别外源性和内源性RNA,启动免疫反应。TLR7与自身免疫性疾病关系密切,如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮。它激活以后,通过分泌以1型干扰素（interferons,IFNs）为特征的细胞因子引起自身免疫性疾病。现在,越来越多的研究把TLR7作为治疗炎症性疾病的靶点。我们猜想,TLR7可能通过调节免疫反应在TAA中起到了一定的作用。因此,为探究TLR7在TAA中发挥的作用及机制,本研究首先通过Real Time-PCR及免疫荧光染色证实TLR7在Tgfbr1sm-ko小鼠主动脉上表达增高。然后通过BAPN+Ang II诱导TLR7基因敲除小鼠TAA形成,明确TLR7对TAA形成和发展的影响,最后阐明其是否能够通过调节免疫反应影响TAA的发生发展。本项目有望为阐明TAA的发生机制提供新的认识,为TAA的防治提供新的靶点。第1章TLR7在平滑肌特异性Tgfbr1缺失小鼠胸主动脉瘤中的表达变化目的:探索TLR7在平滑肌特异性Tgfbr1缺失小鼠胸主动脉瘤中表达情况。方法:利用Cre-loxp系统诱导小鼠平滑肌Tgfbr1缺失(Tgfbr1sm-ko),构建TAA模型。观察小鼠死亡情况,并应用超声监测小鼠升主动脉（Ascending thoracic aorta,ATA）直径;Masson染色检测小鼠ATA病理改变、明胶/原位酶谱检测ATA中MMP-2/MMP-9的活性及分布、免疫组织化学染色和流式细胞学检测ATA中炎症细胞浸润情况;Nano String数字化基因检测技术分析ATA组织中炎症基因的变化;Real Time-PCR检测TLR7在ATA组织中表达的情况、免疫荧光染色检测Tgfbr1sm-ko小鼠与人TAA患者ATA中TLR7的表达情况和分布以及Tgfbr1sm-ko小鼠ATA中TLR7配体8-OHG的表达水平。结果:诱导平滑肌特异性Tgfbr1缺失后,小鼠ATA迅速扩张并出现了主动脉破裂,Masson染色结果显示Tgfbr1sm-ko小鼠ATA的病理特点表现为中膜层变薄或缺失,内膜/中膜撕裂及血管壁内血肿,这些均与胸主动脉瘤患者的病理特征相似。明胶酶谱实验提示Tgfbr1sm-ko小鼠ATA中MMP-2的活性是对照小鼠的2.3倍（P=0.017）,荧光原位酶谱法检测提示MMP-2主要集中在内膜/中膜撕裂口附近。免疫组织化学染色发现Tgfbr1sm-ko小鼠ATA含有更多的CD45+阳性细胞,在第7天和第14天分别是对照小鼠的1.8倍和2.8倍（P均<0.01）。流式细胞检测发现在第7天Tgfbr1sm-ko小鼠ATA中CD45+阳性细胞是Tgfbr1f/f小鼠的1.65倍（P=0.01）,其中CD4+T细胞是Tgfbr1f/f小鼠的1.78倍（P=0.04）;数字化基因检测技术和Real Time-PCR发现TLR7在Tgfbr1sm-ko小鼠ATA中表达上调,在第7天和第14天分别是Tgfbr1f/f小鼠的2.8倍（P=0.007）和10.9倍（P=0.029）。而免疫荧光染色发现TLR7主要分布在中膜层,TLR7的配体8-OHG在Tgfbr1sm-ko小鼠中ATA中增加,TLR7在TAA患者ATA切片中也存在相似的表达情况和分布特点。小结:1.平滑肌Tgfbr1缺乏促进小鼠ATA动脉瘤样改变及破裂;2.平滑肌Tgfbr1缺乏促进小鼠ATA炎症细胞浸润;3.平滑肌Tgfbr1缺乏小鼠ATA中TLR7表达上调。第2章TLR7基因敲除对小鼠胸主动脉瘤形成的影响及其机制研究目的:探索TLR7基因敲除对BAPN+Ang II诱导的小鼠胸主动脉瘤形成的影响及其机制。方法:利用BAPN+Ang II诱导C57BL/6J和TLR7基因敲除小鼠(TLR7-/-)构建TAA模型。观察小鼠死亡情况,并应用超声监测小鼠升ATA直径,明胶酶谱检测MMP-2/MMP-9的活性。微球悬浮列阵实验检测TLR7-/-小鼠细胞因子和趋化因子水平;流式细胞仪检测ATA中炎症细胞浸润情况。利用BAPN+Ang II诱导T-bet基因敲除小鼠(T-bet-/-,体内T细胞倾向于分化成为Th2细胞)研究Th2细胞对小鼠胸主动脉瘤形成的影响。流式细胞仪检测T-bet-/-小鼠ATA中CD4+GATA3+Th2细胞浸润情况以确定Th2细胞偏倚的环境构建成功。观察小鼠死亡情况,并应用超声监测小鼠升ATA直径,明胶酶谱检测MMP-2/MMP-9的活性;微球悬浮列阵实验检测T-bet-/-小鼠外周循环和ATA中细胞因子和趋化因子水平;流式细胞仪检测ATA中炎症细胞浸润情况;α-actin染色检测T-bet基因敲除小鼠ATA SMCs丢失情况;Western blotting观察IL-13处理的SMCs坏死性凋亡情况。结果:BAPN+Ang II处理TLR7-/-小鼠后主动脉迅速扩张并出现了主动脉破裂,4周内,100%的TLR7-/-小鼠死于动脉瘤破裂。与C57BL/6J小鼠相比,TLR7-/-小鼠ATA中的MMP-2活性高40%（P<0.05）,CCL-5（725.2±36.4 vs 1063.1±64.6 pg/ml,P=0.01）、Eotaxin（142.9±20.4 vs 220.5±17.4 pg/ml,P=0.038）和IL-13（113.6±8.0 vs 129.6±9.7 pg/ml,P=0.016）增多,更多CD4+T细胞（13.3%±1.49%vs19.9%±1.18%,P=0.04）、CD4+GATA3+Th2细胞（4.9%±1.5%vs 2.7%±1.5%,P=0.04）浸润;BAPN+Ang II处理T-bet-/-小鼠后,CD4+GATA3+Th2细胞在ATA浸润增多（6.3%±2.5%vs 9.8%±3.4%,P=0.029）,构建了Th2细胞偏倚的环境。T-bet-/-小鼠主动脉同样快速扩张并出现了主动脉破裂,4周内,90%的小鼠死于动脉瘤破裂。与TLR7-/-小鼠一致,T-bet-/-小鼠ATA中的MMP-2活性增高30%（P=0.02）,CCL5（709.1±46.4 vs 889.6±114.8 pg/ml,P=0.02）和IL-13（112.5±7.7 vs131.7±6.3 pg/ml,P=0.007）增多。除此之外,T-bet-/-小鼠ATA中CD19+B细胞增多（9.8%±3.1%vs 13.1%±3.5%,P=0.017）,SMCsα-actin减少,IL-13体外处理SMCs使坏死性凋亡的标志物RIP-3表达上调（P<0.05）。小结:1.TLR7基因敲除加重BAPN+Ang II诱导的小鼠TAA,小鼠死亡率增加。2.TLR7基因敲除后可能通过促进Th2细胞极化,IL-13的分泌增多,加重小鼠TAA。结论:1.TLR7在Tgfbr1sm-ko TAA模型小鼠ATA组织中表达上调。2.TLR7基因敲除可加重BAPN+Ang II诱导的胸主动脉瘤扩张及破裂。其机制涉及驱使Th2细胞极化并产生IL-13等相关细胞因子加重对主动脉的损害。