研究背景内皮细胞损伤和功能不全是血管损伤后有害修复、动脉粥样硬化的始动因素和根本原因,平滑肌细胞增生迁移是其继发因素和外在表现。修复损伤血管的关键在于抑制平滑肌细胞过度增生与促进损伤内皮重建。既往关于增殖性血管疾病治疗的研究热点主要集中于平滑肌细胞增生机制的探讨及如何有效抑制平滑肌细胞过度增生。雷帕霉素和紫杉醇药物洗脱支架是临床防治损伤血管过度的有效手段,但往往会干扰内皮修复,引起损伤血管段再内皮化不全或延迟及迟发性支架内血栓形成。因此,筛选选择性抑制新生内膜增生不影响甚至损伤血管再内皮化的洗脱支架包被药物是新一代洗脱支架的研制方向。既往认为,参与损伤血管修复的细胞成分是血管壁平滑肌细胞和内皮细胞。近来研究发现,骨髓中存在血管祖细胞——平滑肌祖细胞(smooth muscle progenitor cells, SPCs)和内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)。血管损伤后这些细胞可动员入外周血,归巢于损伤血管段,平滑肌祖细胞分化为平滑肌细胞,促进新生内膜生成,同时可导致管腔狭窄;内皮祖细胞分化为内皮细胞,重建管腔内皮细胞单层,抑制损伤血管有害重构。最近动物实验和临床研究均证实新生内膜中约一半以上平滑肌细胞是骨髓来源的,约25%内皮细胞是内皮祖细胞来源的。说明骨髓源平滑肌祖细胞和内皮祖细胞是参与损伤血管修复的重要细胞源。因此,抑制平滑肌祖细胞增殖可减少血管损伤后新生内膜过度增生,促进内皮祖细胞增殖,有助于损伤血管再内皮化,抑制新内膜发展。他汀类药物具有良好的调脂作用,能够降低低密度脂蛋白胆固醇和升高高密度脂蛋白胆固醇。同时,在胆固醇水平相当的情况下,他汀类药物能显著降低心血管事件的发生率。此外,他汀类药物还具有抑制血小板聚集和血管中膜平滑肌细胞增殖,改善内皮功能,抑制炎症反应及增加斑块稳定性作用。新近研究显示他汀类药物能增加内皮祖细胞数量、改善内皮祖细胞功能。他汀类药物的这些生物学效应提示其有可能成为理想的第二代洗脱支架药物。由于损伤位点有效药物浓度过低,临床口服他汀类药物并不能抑制支架内再狭窄。局部用药有靶区有效血药浓度高、作用时间长和全身毒性低优点。尚不清楚局部应用他汀类药物能否有效抑制新生内膜增生,同时加速损伤区再内皮化。研究目的:1.观察临床广泛应用的洗脱支架包被药物雷帕霉素对内皮祖细胞和平滑肌祖细胞分化、增殖、迁移和黏附的影响;2.观察辛伐他汀对血管内皮细胞、平滑肌细胞、内皮祖细胞和平滑肌祖细胞分化、增殖、迁移和黏附的影响。3.观察辛伐他汀对平滑肌细胞表达平滑肌祖细胞趋化因子SDF-1α的影响;4.建立大鼠颈动脉球囊损伤模型,观察局部应用辛伐他汀能否抑制损伤血管新生内膜过度增生并促进损伤血管再内皮化,为应用他汀类药物包被洗脱支架提供实验依据。实验方法1.观察雷帕霉素对内皮祖细胞和平滑肌祖细胞分化、增殖、迁移和黏附的影响:采用密度梯度离心法从大鼠骨髓获取单个核细胞,分别重悬于平滑肌祖细胞和内皮祖细胞培养基中,接种在纤维连接素包被培养板,加入不同浓度雷帕霉素(0,0.01,0.1,1,10,100 ng/ml),培养12天后,α-SMA和CD34免疫荧光染色鉴定骨髓源性平滑肌祖细胞,荧光显微镜鉴定FITC-UEA-Ⅰ和Di I-acLDL双染阳性细胞为正在分化的内皮祖细胞,并在倒置荧光显微镜下计数。收集原代培养8天贴壁细胞,分别加入不同浓度雷帕霉素(0,0.1,1,10,100,200 ng/ml)培养0、12、24、48、96 h。然后分别采用MTT比色法、改良的Boyden小室和黏附能力测定实验观察内皮祖细胞和平滑肌祖细胞的增殖、迁移和黏附能力。2.观察辛伐他汀对血管内皮细胞、平滑肌细胞、内皮祖细胞和平滑肌祖细胞分化、增殖、迁移和黏附的影响:分别采用酶消化法和组织块法分离培养大鼠血管内皮细胞和平滑肌细胞,加入不同浓度辛伐他汀(0,0. 01,0.1,1,10μmol/L)培养0、6、12、24、48 h,然后分别采用3H-TdR掺入法、改良的Boyden小室和黏附能力测定实验观察内皮细胞和平滑肌细胞的增殖、迁移能力。采用前述方法分离培养内皮祖细胞和平滑肌祖细胞,将其接种在纤维连接素包被培养板,加入不同浓度辛伐他汀(0,0. 01,0.1,1,10μmol/L),培养8 d,前述方法鉴定内皮祖细胞和平滑肌祖细胞,倒置荧光显微镜下计数。收集原代培养8 d的内皮祖细胞和平滑肌祖细胞,分别加入不同浓度辛伐他汀(0,0. 01,0.1,1,10μmol/L)培养0、6、12、24、48 h。然后分别采用3H-TdR掺入法、改良的Boyden小室和黏附能力测定实验观察内皮祖细胞和平滑肌祖细胞的增殖、迁移和黏附能力。Western blot检测不同浓度辛伐他汀(0,0. 01,0.1,1,10μmol/L)作用24小时对内皮细胞、平滑肌细胞、内皮祖细胞和平滑肌祖细胞周期抑制蛋白P27表达的影响。3.观察辛伐他汀对平滑肌细胞表达平滑肌祖细胞趋化因子SDF-1α的影响:不同浓度辛伐他汀(0,0. 01,0.1,1,10μmol/L)干预平滑肌细胞24 h,1μmol/L辛伐他汀干预平滑肌细胞6～48 h ,RT-PCR检测SDF-1αmRNA表达。4.局部应用辛伐他汀对损伤血管新生内膜过度增生和再内皮化影响:建立大鼠颈动脉球囊损伤模型,将400μg辛伐他汀溶于50μl F-127基质胶中,加在颈动脉外膜区域模拟洗脱支架。2周后,处死动物,取目标血管段,固定,石蜡包埋切片,HE染色观察新生内膜厚度,vWF染色观察损伤血管再内皮化程度。主要结果1.雷帕霉素对内皮祖细胞和平滑肌祖细胞分化、增殖、迁移和黏附的影响:成功分离培养骨髓源内皮祖细胞和平滑肌祖细胞。内皮祖细胞vWF染色阳性,UEA-Ⅰ和DiLDL双染色阳性,可见梭形细胞首尾相连形成线状结构。平滑肌祖细胞α-SMA、CD34染色阳性。雷帕霉素浓度依赖性抑制骨髓单个核细胞向内皮祖细胞和平滑肌祖细胞分化。0.1 ng/ml的雷帕霉素作用12天,分化EPC数量减少59.3±5.8%(n=5,P<0.01),平滑肌祖细胞数量减少70.5±34.5%(n=5,P<0.01)。雷帕霉素浓度和时间依赖性抑制内皮祖细胞和平滑肌祖细胞增殖。1 ng/ml作用24 h显著抑制EPC (1 ng/ml雷帕霉素组与对照组之比为0.418±0.018 vs 0.580±0.034,n=5,P<0.01)和SPC(1 ng/ml雷帕霉素组与对照组之比为0.476±0.016 vs 0.687±0.043,n=5,P<0.01)增殖。1 ng/ml雷帕霉素作用12 h对EPC和SPC增殖无明显影响(n=5,P>0.05)。0.1 ng/ml雷帕霉素对EPC和SPC增殖影响不明显(n=5,P>0.05)。雷帕霉素也浓度依赖性抑制EPC和SPC迁移和黏附能力。2.辛伐他汀对血管内皮细胞、平滑肌细胞、内皮祖细胞和平滑肌祖细胞分化、增殖、迁移和黏附的影响:辛伐他汀浓度和时间依赖性抑制平滑肌细胞增殖和迁移。0.01μmol/L辛伐他汀即可抑制平滑肌细胞增殖(0.01μmol/L辛伐他汀组与对照组之比为5647±268 vs 6038±218,n=5,P<0.05)和迁移(0.01μmol/L辛伐他汀组与对照组之比为41±3 vs 45±3,n=5,P<0.05)。0.01～10μmol/L的辛伐他汀不影响内皮细胞增殖(10μmol/L辛伐他汀组与对照组之比为4310±132 vs 4321±133,n=5,P>0.05)和迁移(10μmol/L辛伐他汀组与对照组之比为35±5 vs 37±5,n=5,P>0.05)。辛伐他汀浓度依赖性抑制骨髓单个核细胞向平滑肌祖细胞分化,促进其向内皮祖细胞分化。1μmol/L辛伐他汀作用24小时分化平滑肌祖细胞减少62.1±3.5%(1μmol/L辛伐他汀与对照组之比为32±5 vs 85±4,n=5,P<0.01),内皮祖细胞增加1.2±0.1倍(1μmol/L辛伐他汀与对照组之比为87±5 vs 39±4,n=5,P<0.01)。辛伐他汀浓度和时间依赖性促进内皮祖细胞增殖,最大作用剂量1.0μmol/ L,24 h达作用高峰。浓度和时间依赖性抑制平滑肌祖细胞增殖,1.0μmol/ L辛伐他汀作用24小时,内皮祖细胞数量增加2.2±0.1倍(1μmol/L辛伐他汀与对照组之比为3762±138 vs 1249±146,n=5,P<0.01),平滑肌祖细胞数量减少62.1±5.6%(1μmol/L辛伐他汀与对照组之比为1962±145 vs 4070±184,n=5,P<0.01)。辛伐他汀也抑制平滑肌祖细胞迁移和黏附,促进内皮祖细胞迁移和黏附。辛伐他汀浓度依赖性促进平滑肌细胞和平滑肌祖细胞周期抑制蛋白P27表达,抑制内皮祖细胞P27表达,不影响内皮细胞P27表达。3.辛伐他汀对平滑肌细胞表达平滑肌祖细胞趋化因子SDF-1α的影响:辛伐他汀浓度和时间依赖性抑制平滑肌细胞SDF-1αmRNA表达。4.局部应用辛伐他汀对大鼠损伤血管新生内膜过度增生和再内皮化影响:局部应用辛伐他汀抑制大鼠损伤颈动脉新生内皮过度增生,对照组与辛伐他汀组新生内膜面积之比为0.58±0.13 mm~2 vs 0.27±0.12 mm~2 (n=6,P<0.01),辛伐他汀组内膜/中膜比减少(对照组与辛伐他汀组之比为1.95±0.27 vs 0.97±0.24,n=6,P<0.01)。内皮细胞vWF免疫组化染色未观察到对照组和辛伐他汀组再内皮化差异。全文结论1.雷帕霉素时间和浓度依赖性抑制骨髓源平滑肌祖细胞分化、增殖、迁移和黏附;雷帕霉素也减少骨髓源内皮祖细胞数量和抑制其功能。寻找新的洗脱支架药物需考虑其对平滑肌祖细胞和内皮祖细胞的影响。2.辛伐他汀选择性促进骨髓单个核细胞向内皮祖细胞分化,促进内皮祖细胞增殖、迁移和黏附,抑制其向平滑肌祖细胞分化。抑制平滑肌细胞和平滑肌祖细胞增殖、迁移和黏附,不影响内皮细胞增殖和迁移。3.辛伐他汀浓度和时间依赖性抑制平滑肌细胞SDF-1αmRNA表达,间接抑制平滑肌祖细胞参与的新生内膜增生。4.局部应用辛伐他汀能有效抑制损伤动脉新内膜过度增生,不影响损伤血管段再内皮化。