目的：肾综合症出血热(HFRS)是由布尼亚病毒科(Bunyaviridae)汉坦病毒属中的病原体引起的一种病情重、病死率高的自然疫源性急性传染病。由于HFRS发病机制尚不清，临床表现多样且病情危重易变，所以目前仍无特效的治疗方法，因此研究一种有效的特异性免疫制剂是国内外学者共同关注的。核酸疫苗的问世给汉坦病毒的疫苗研制提供了新思路，它具备一些传统疫苗无法比拟的优点，如成本低、免疫力持久等。汉坦病毒G2包膜糖蛋白含有两个中和性的抗原位点，且不同型别间的交叉反应G2多于G1，它的这些特性为其作为汉坦病毒核酸疫苗的候选基因提供了理论依据，因此我们以G2糖蛋白基因作为候选基因构建了真核表达载体pcDNA3.1+/G2，并观察此重组体可否在真核细胞中表达，及此重组体对动物的免疫效果；鉴于目前基因疫苗的一个普遍的缺点是其免疫原性较弱，为了提高重组体的免疫原性，我们在实验中同时应用免疫佐剂CpGDNA，以提高重组体对动物的免疫效果；核酸疫苗的安全性是目前最具争议的问题，因此本实验在观察重组体对动物免疫效果的同时，对其可否与免疫动物染色体基因组整合进行了初步探讨，从而为其进一步的实验奠定基础。 方法：参照Genebank中汉坦病毒76-118株全长基因序列，设计两对引物，其中一对引物两端分别引入EcoRⅠ/XbaⅠ两个酶切位点，另一对引物两端分别引入一段适合小鼠的免疫刺激序列(ISS)GACGTT，及两个酶切位点：HindⅢ/XhoⅠ。常规PCR扩增两段G2基因片段，得到含有及不含免疫刺激序列的PCR片段，并将两种PCR产物与T载体pMD18-T相连，构建了载体pMD18-T/G2及pMD18-T/G2(ISS)，酶切、测序后以EcoRⅠ/XbaⅠ双酶切pMD18-T/G2及pcDNA3.1+，HindⅢ/XhoⅠ双酶切pMD18-T/G2(ISS)及pcDNA3.1+，将两G2基因片段与pcDNA3.1+连接，构建载体pcDNA3.1+/G2及pcDNA3.1+/G2(ISS)，将两重组体转染人Vero-E6细胞中，观察其可否在真核细胞中表达。质粒大提后调节浓度至1mg/ml，进行动物的免疫接种，6-8周龄小鼠，随机分成六组，分别接种PBS、pcDNA3.1+、pcDNA3.1+/G2、pcDNA3.1+/G2(ISS)、pcDNA3.1+/G2与CpG-ODN的混合物。第一次免疫后间隔两周进行再次免疫，共进行三次免疫。初次免疫后15、30、45、60天收集各组免疫小鼠的血清及脾细胞以ELISA法检测G2包膜糖蛋白抗体、IL-4及IFN-γ的分泌水平；MTT检测T细胞增殖反应；流式细胞仪观察CD4+T细胞CD8+T细胞亚群的变化，从而了解各组小鼠的免疫状态，判断重组体对动物的免疫效果，及CpGDNA对G2包膜糖蛋白基因疫苗是否具有免疫增强作用。初次免疫后14周，处死注射PBS及pcDNA3.1+/G2组动物，取肺脏及脾脏后进行基因组DNA的提取，利用原引物，以提取的基因组DNA为模板行PCR扩增以观察重组体pcDNA3.1+/G2可否与宿主染色体基因组DNA发生整合。 结果：PCR扩增后得到的含ISS及不含ISS的G2基因片断与T载体连接后无论是菌落PCR鉴定还是酶切鉴定都与预期结果相同，测序后验证PCR产物与Genebank中76-118G2基因片断同源性分别都达到99％。将两种真核表达载体pcDNA3.1+/G2、pcDNA3.1+/G2(ISS)转染至Vero-E6细胞中后，均可在细胞浆见绿色荧光，说明两重组体中可在真核细胞中进行G2包膜糖蛋白的表达，且具有抗原性。动物免疫结果发现，随着免疫次数的增加接种pcDNA3.1+/G2、pcDNA3.1+/G2(ISS)及pcDNA3.1+/G2与CpG-OND的混合组，各项免疫指标即CD4+及CD8+T细胞的百分率、IL-4及IFN-γ分泌水平、抗体的分泌水平、脾淋巴细胞增殖活性都有一定程度的升高，但是IL-4的分泌水平要明显优于IFN-γ的分泌水平，其中pcDNA3.1+/G2(ISS)及pcDNA3.1+/G2与CpG-OND混合组升高水平明显高于pcDNA3.1+/G2组，而pcDNA3.1+/G2组又明显优与空质粒pcDNA3.1+注射组，PBS对照组一直维持较低水平，但是初次免疫后15天、30天各项免疫指标的升高水平并不明显，直至初次免疫后45天达到高峰，60天后有一定程度的回落，且pcDNA3.1+/G2(ISS)及pcDNA3.1+/G2与CpG-OND混合组的免疫水平基本持平，都优于pcDNA3.1+/G2组。值得注意的是，空质粒pcDNA3.1+注射组不论是IFN-γ还是CD8+T细胞的百分率在免疫后都有小幅度的上扬，升高水平优于IL-4及CD4+T细胞的升高水平。最后在基因整合性的实验中并未观察到重组体pcDNA3.1+/G2的基因与宿主染色体基因组DNA发生整合。 结论：G2包膜糖蛋白诱导以Th2型即体液免疫为主免疫应答反应，因此本实验以G2包膜糖蛋白基因为候选基因构建了真核表达载体pcDNA3.1+/G2，在随后的动物免疫中发现此重组体可以诱导免疫小鼠产生以体液免疫为主的应答反应，因此以G2包膜糖蛋白基因作为汉坦病毒核酸疫苗的候选基因是可行的；但G2包膜糖蛋白的免疫原性较弱，因此以CpGDNA作为免疫佐剂协同重组体对动物的免疫，实验发现CpGDNA可提高G2包膜糖蛋白基因疫苗的免疫应答能力，因此可望将CpGDNA作为汉坦病毒核酸疫苗的基因佐剂；DNA疫苗研究中，一个最重要的理论危机是质粒DNA与宿主基因组整合的问题，如外源DNA与基因组整合可导致肿瘤细胞形成，初次免疫后14周发现G2包膜糖蛋白核酸疫苗并未与免疫动物细胞的DNA整合，这为汉坦病毒基因疫苗的研制奠定了基础。