家蚕“明”死卵突变体l-e~m基因的定位克隆及功能研究

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家蚕是一种完全变态昆虫,以卵滞育,可以说卵是家蚕生命周期中的第一个发育阶段,蚕卵品质的好坏直接影响到幼虫、蛹和成虫的发育。正常卵通常呈短椭圆形、侧面扁平且有轻微凹陷。本课题研究对象“明”死卵突变体(lethal egg of“ming”, l-em)是在实用品种“苏·菊×明·虎”母本品系“明”的生产和保存过程中发现的一种死卵突变体,在产卵后一小时左右出现三角形凹陷,表现失水死亡特征;遗传分析发现该突变由一对隐性基因控制,纯合致死,遵循伪母性遗传规律;扫描电镜观察突变体卵壳,发现卵壳表面凹陷处小室的边缘有明显的裂纹,卵壳纵断面中间层亦出现不连续的裂缝。本研究在对l-em卵突变体遗传分析及表型观察的基础上,采用图位克隆技术对l-em基因进行了定位克隆,采用qRT-PCR、2-DE、RNAi等技术对候选基因进行表达分析和功能验证。主要研究结果如下:一、l-em基因的定位选择l-em卵突变体隐性纯合的雄性亲本(P1)与p50近交系的雌性亲本(P2)杂交,组配F1代群体;F1代雌性个体与雄性亲本(P1)回交,同时进行蛾区内自交分别组配BC1F群体及F2代群体。使用P1、P2和F1筛选了28个连锁群上具有多态性的SSR分子标记,并使用BC1F群体确定了l-em基因位于家蚕第十连锁群;进一步对2287个F2代群体中产死卵的雌性个体检测,使用13个与l-em基因连锁的具有多态性的SSR标记,将l-em基因定位于S65与S82两个标记之间,相距约360kb,绘制出l-em基因的分子标记遗传连锁图谱;通过与家蚕基因组比对查明该区域内包含24个基因。二、候选基因的表达模式、基因结构分析和功能验证通过对24个基因在正常蛾及l-em卵突变体蛾卵巢内的表达分析,明确了2个差异表达基因BmVMP23和BmEP80为候选基因。BmVMP23基因的表达量在l-em卵突变体的卵巢中出现明显下调,而在l-em卵突变体的卵巢中则未检测到BmEP80基因的表达。反向PCR分析测序显示BmVMP23基因终止密码子后的第22个碱基至BmEP80基因ORF的第161个碱基间发生了突变,导致BmVMP23基因的3′-UTR和BmEP80基因结构的不完整性。对2个候选基因的RNAi试验表明,经BmEP80基因干扰后的部分雌蛾所产卵发生明显的凹陷,且表型与l-em卵突变体所产卵的表型相似,而对BmVMP23基因干扰未见此现象。因而推断BmEP80基因的突变是导致l-em卵突变体产生的主要原因。三、l-em突变体卵巢组织差异蛋白质分析通过双向电泳技术对正常个体及l-em卵突变体的卵巢组织进行蛋白质组学分析,结果显示BmEP80基因所编码的BmEP80蛋白从蛹期第九天开始在正常个体卵巢中大量表达,而在l-em卵突变体的卵巢中则未检测到该蛋白的表达。除了BmEP80蛋白之外的其他蛋白在正常个体和l-em卵突变体之间无明显差异。进一步说明了BmEP80蛋白的缺失是l-em卵突变体产生的主要原因。四、候选基因BmVMP23的表达调控分析鉴于l-em卵突变体的BmVMP23基因的3′-UTR结构被破坏,而3′-UTR为miRNAs的调控位点,为了分析miRNA对BmVMP23基因的表达调控作用,将BmVMP23基因的3′-UTR序列与家蚕的miRNAs序列比对,发现了一个与BmVMP23基因的3′-UTR序列匹配度极高的miRNA(bmo-miR-1a-3p)。荧光实时定量检测该miRNA在正常个体卵巢中表达量较高,且其表达趋势与BmVMP23基因的表达趋势相反,而在l-em卵突变体卵巢中仅有微量表达。通过miRNAmimic过表达和miRNA inhibitor抑制表达体外转染实验证实了bmo-miR-1a-3p能够抑制BmVMP23基因的表达。上述研究证实了卵黄膜蛋白BmEP80基因的突变是导致l-em卵突变体产生的主要原因,该研究为“明”死卵基因突变的分子机制的阐明提供了重要的理论依据,具有重要的科学意义和价值。
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