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脑心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus,EMCV）属于微RNA病毒科心病毒属成员,是一种无囊膜、单股正链的RNA病毒,是一种重要的人畜共患病病原体。EMCV感染后可造成仔猪急性致死性心肌炎,致死率可高达100%。本研究以我国中东地区EMCV NJ08分离株为材料,采用体内转录的方法成功建立了此毒株的反向遗传操作系统,成功拯救到病毒,并对该病毒的生物学特性进行鉴定;拯救病毒的免疫原性也得到初步的研究,为今后深入研究脑心肌炎病毒的分子致病机制、基因功能以及新型疫苗奠定了基础。具体研究内容如下:1猪脑心肌炎病毒感染性克隆的构建及鉴定本研究采用RT-PCR方法获得覆盖EMCV NJ08株全基因组（GenBank HM641897）的A、B和C三个基因片段,其中C片段第6243位的T突变为A,引入EcoRI标记位点,分别克隆至pEasy simple Blunt载体,基因测序正确。采用PacI、XhoI、NheI和SpeI将3个片段依次克隆至CMY-β质粒,获得含EMCV全基因组cDNA的重组质粒pCMV-NJ08。采用脂质体将其转染至BHK-21细胞,结果出现明显细胞病变,经RT-PCR产物EcoRI酶切和间接免疫荧光试验鉴定,证明获得重组EMCV rNJ08;拯救病毒rNJ08株在BHK21细胞上的TCID50、一步生长曲线和空斑形态与亲本毒NJ08相似,但对小鼠致病性明显降低,为该病毒致病机制及疫苗研制奠定了重要基础。2重组脑心肌炎病毒灭活疫苗小鼠免疫特性本研究使用终浓度为0.002mM的BEI将重组病毒（rNJ08）和亲本病毒（NJ08）进行灭活处理,加入ISA15A和ISA206佐剂分别配制成灭活疫苗。将6周龄ICR小鼠随机分成8组,每组5只。第1、2组分别皮下注射由ISA15A佐剂配制的NJ08和rNJ08灭活疫苗,第3、4组分别皮下注射由ISA206佐剂配制的NJ08和rNJ08灭活疫苗(抗原浓度均为107 TCID50/0.2ml)。第5-7组依次皮下多点注射等体积的由ISA15A佐剂配制的梯度抗原浓度(106TCID50/0.2ml、105 TCID50/0.2ml、104TCID50/0.2ml)的 rNJ08灭活疫苗;第8组皮下注射2%DMEM作为阴性对照。间隔三周进行加强免疫。首免后3周采集小鼠血清测其ELISA抗体水平;二免后3周采集血清测定ELISA抗体效价和中和抗体效价,同时分离脾脏淋巴细胞进行淋巴细胞增殖转化试验。结果为:rNJ08疫苗免疫组ELISA和中和抗体水平具有明显的抗原剂量依赖性关系;各免疫组小鼠血清ELISA和中和抗体水平在加强免疫后显著提高（1:16以上）·淋巴细胞增殖试验结果显示,接种相同剂量的各免疫组刺激指数均在3.0左右。结果表明rNJ08与NJ08具有相似的免疫原性,均能有效地刺激机体产生良好的免疫反应,并能产生中和抗体。由于该重组病毒毒力较弱,因此,安全性更高。