论文部分内容阅读
前言阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是一种多见于老年人的神经系统变性疾病,表现为进行性记忆力减退和痴呆、认知障碍、运动障碍。其特征性病理学改变是神经纤维缠结（neuofibrillary tangle,NFT）,大量记忆性神经元数目减少,以及老年斑（senile plaque,SP）的形成。β淀粉样蛋白（Aβ）是老年斑的主要成分,它的异常沉积是AD发病的重要危险因素。β淀粉样蛋白具有神经毒性,可诱导神经元凋亡。用Aβ25-35直接诱导PC12细胞凋亡建立AD细胞模型是体外进行AD研究的理想模型。大量的实验已证明亲环素A（cyclophilin A,CyPA）可以保护神经元抵抗氧化应激等损伤。Boulos等研究了CyPA的作用,发现在大鼠皮层神经元由腺病毒介导CyPA的过表达可以明显保护神经元抵抗氧化应激和缺血性损伤,并且利用在培养的神经元中加入纯化的CyPA蛋白也可保护神经元抵抗氧化应激和缺血性损伤。因此本实验以Aβ25-35损伤PC12细胞为模型,研究CyPA是否对Aβ25-35诱导PC12细胞损伤具有神经保护作用。资料与方法将PC12细胞分为3组:正常对照组,Aβ损伤组,药物保护组。Aβ损伤组用Aβ25-35处理细胞,药物保护组在用Aβ25-35处理前30分钟加入重组的人亲环素A（rhCyPA）。1、用MTT法检测细胞存活率:将PC12细胞接种于96孔细胞培养板,分组分别加药,加入MTT15μl继续培养4h,加入DMSO100μl,用酶标仪在570nm波长处读取各组细胞的吸光值（OD值）,减去背景OD值。2、采用HE染色法观察细胞形态。3、用免疫组织化学方法检测bcl-2,bax蛋白的表达。采用SABC法,将PC12细胞爬片固定,按免疫组织化学方法染色。Metamorph软件分析吸光度,用吸光度（OD值）表示蛋白的表达水平。4、Annexin-V流式细胞仪检测凋亡率。将PC12细胞接种于25ml培养瓶中,按分组分别加药。收集细胞制备单细胞悬液,将等体积的细胞悬液和PI染液混合,送流式细胞仪检测。数据用SPSS12.0软件包进行分析,数据以均数±标准差表示,统计分析用t检验。认为P＜0.05结果有统计学意义。实验结果1、MTT法检测细胞存活率:Aβ损伤组与对照组相比较OD值及细胞存活率显著降低,药物保护组与Aβ损伤组相比OD值及细胞存活率显著升高。2、HE染色光镜下观察:（1）对照组:正常PC12细胞单层生长,胞体饱满,细胞数量多,细胞间联系紧密,相互交织成簇状;（2）Aβ损伤组:胞核固缩、胞浆呈淡红色,细胞数量明显减少;（3）药物保护组:部分细胞可见胞核固缩,细胞数量较Aβ损伤组明显增多。3、免疫组织化学实验结果可见Aβ损伤组中bcl-2的表达比正常对照组低,bax的表达比正常对照组高;药物保护组bcl-2的表达比Aβ损伤组升高,bax的表达比Aβ损伤组降低。4、流式细胞仪检测凋亡率:Aβ损伤组细胞凋亡百分率明显升高,药物保护组细胞凋亡百分率明显降低。结论CyPA对Aβ25-35诱导PC12细胞损伤具有一定的保护作用。CyPA能上调Aβ25-35诱导PC12细胞bcl-2的表达,抑制bax的表达。