大蒜休眠相关基因的筛选及快速打破鳞茎休眠的方法研究

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大蒜(Allium sativumL.)具有自然休眠的生理特性,休眠期间,大蒜鳞茎水分及各种营养物质含量下降,品质降低,对大蒜的生产及商品品质有不利的影响,研究大蒜休眠机理及快速打破其休眠的方法具有现实意义。本试验从植物生理和分子生物学两方面入手,通过不同浓度的GA3、ETH结合低温处理大蒜鳞茎,以期探明快速解除金乡蒜休眠的技术与生理特性变化,并利用高通量测序技术,对不同时间清水浸泡处理的金乡蒜进行了转录组分析,研究了清水处理时间对大蒜打破休眠、促进其萌发分子机制的影响,筛选出其中与休眠萌发相关的差异基因,促进了大蒜生理代谢休眠和萌发相关基因的发现,有利于对大蒜休眠分子机制的研究。  通过研究得到以下结论:  (1)探明了快速打破休眠的方法技术,GA3、ETH浓度分别为50mg·L-1、188.7mg·L-1的混合溶液浸泡大蒜鳞茎1h后的萌芽速度最快,浸泡后进行20天12℃的低温处理,可有效打破大蒜休眠,使大蒜鳞茎的休眠期缩短40天以上。且此方法对后期大蒜幼苗生长没有不利影响,不影响大蒜幼苗的品质。  (2)经过0h、2h、8h、24h清水浸泡处理后的大蒜鳞茎,内芽生长及鳞茎萌发随浸水时间的增加而加快。样品经过转录组测序后,最终获得36.09Gb数据,165,810个大蒜ALL-Unigene,总长度为159,552,541bp,N50长度为1,504bp,GC含量为39.11%。  (3)获得的ALL-Unigene与NR、NT、Swissprot、COG、KEGG、GO及Interpro七大功能数据库进行比对后,分别有69,425、44,541、47,558、25,880、52,506、10,878和46,192个获得功能注释。通过与COG数据库的比对,将其分为25个不同功能注释,其中涉及一般功能预测,复制、重组和修复,转录,翻译后修改、蛋白质周转、伴侣蛋白,翻译、核糖体结构和生物合成,信号转导机制等功能基因分布较多。对ALL-Unigene进行GO和Pathway富集分析,得到53个不同功能分类和21个代谢通路。根据注释结果共检测出68,527个CDS,未注释上的Unigene使用ESTScan预测后获得6,227个CDS。  (4)通过对ALL-Unigene的SSR进行检测,共识别到11,648个SSR,其中5,283个SSR分布于10,235个Unigene中,分布SSR数量最多的类型为单核苷酸型。  (5)通过对不浸泡和清水浸泡2h的大蒜内芽进行差异表达分析,得到差异表达基因有2,799个,其中上调表达的差异基因有1,483个,下调表达的有1,316个;对不浸泡和清水浸泡8h的大蒜内芽差异表达分析后,得到差异表达基因有2,246个,其中上调表达的差异基因有1,190个,下调表达的有1,056个;对不浸泡和清水浸泡24h的大蒜内芽进行差异表达分析,得到两组的差异表达基因有3,516个,其中上调表达的差异基因有2,096个,下调表达的有1,420个。利用qRT-PCR对代表性基因的表达水平进行验证,与Illumina测序结果一致,表明Illumina Hiseq平台测得的基因表达数据具有较高的可靠性。  (6)对大蒜内芽差异表达基因进行GO和Pathway富集分析,与休眠萌发相关的GO通路中,在D组表达量高的基因NR注释为与生理代谢有关的水解酶、蛋白酶,还有部分与赤霉素、脱落酸合成途径有关的信号物质。在KEGG信号转导途径中,与激素信号转导有关的差异基因随浸泡时间增加表达升高。  (7)对植物激素信号转导通路进行重点分析,筛选得到与大蒜休眠相关的上调基因AsGA3ox,AsSAUR和AsBRI1及一系列下调基因。
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