论文部分内容阅读
目的:短链酰基辅酶A脱氢酶(short-chain acyl-Co A dehydrogenase,SCAD)是线粒体脂肪酸β氧化的限速酶。前期研究显示,PPARα介导了SCAD对心肌纤维化的调控作用。本文旨在研究PI3K/ERK1/2/NF-κB/PPARα/SCAD信号途径对心肌纤维化的调控作用,阐明SCAD调控心肌纤维化的新机制。方法:1、采用自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)作为心肌纤维化模型,并进行游泳运动干预。Western blot检测PI3K p110α、PI3K p110γ、p-ERK1/2、p-IκBα、p-p65蛋白表达变化。Western blot及Real-time PCR检测SCAD、PPARα及纤维化指标α-SMA、Collagen I和Collagen III蛋白和m RNA水平。同时检测SCAD酶活性、ATP含量及游离脂肪酸含量。2、采用血管紧张素II(angiotensin,Ang II)刺激原代培养正常大鼠的心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts,CFs)构建心肌纤维化体外模型。Western blot检测PI3K p110α、PI3K p110γ、p-ERK1/2、p-IκBα、p-p65蛋白表达变化。Western blot及Real-time PCR检测SCAD、PPARα及纤维化指标α-SMA、Collagen I和Collagen III蛋白和m RNA水平。检测SCAD酶活性、ATP含量及游离脂肪酸含量。3、分别采用NF-κB p65激动剂LPS、抑制剂Maslinic acid及PPARα激动剂非诺贝特(Fenofibrate,Feno)预处理30min后,再以Ang II刺激CFs。Western blot检测p-p65蛋白表达,Western blot及Real-time PCR检测SCAD、PPARα及纤维化指标α-SMA、Collagen I和Collagen III蛋白和m RNA。检测SCAD酶活性、ATP、游离脂肪酸和羟脯氨酸含量、细胞增殖率。4、分别采用ERK1/2激动剂EGF、抑制剂PD98059及NF-κB p65抑制剂Maslinic acid预处理30min后,再以Ang II心刺激CFs。Western blot检测p-ERK1/2、p-IκBα及p-p65蛋白表达水平,Western blot及Real-time PCR检测SCAD、PPARα及纤维化指标α-SMA、Collagen I和Collagen III蛋白和m RNA。检测SCAD酶活性、ATP、游离脂肪酸和羟脯氨酸含量、细胞增殖率。5、分别采用PI3K p110α抑制剂A66及PI3K p110γ抑制剂AS605240预处理30min后,再以Ang II刺激CFs。Western blot检测PI3K p110α、PI3K p110γ、p-ERK1/2、p-IκBα和p-p65蛋白表达变化,Western blot及Real-time PCR检测SCAD、PPARα及纤维化指标α-SMA、Collagen I和Collagen III蛋白和m RNA。检测SCAD酶活性、ATP、游离脂肪酸和羟脯氨酸含量、细胞增殖率。结果1.SHR在20周龄时呈现心肌纤维化,PI3K p110α、PPARα及SCAD表达显著下调,PI3K p110γ、p-ERK1/2、p-IκBα、p-p65蛋白表达显著上调。同时,SCAD酶活性降低、脂肪酸氧化能力减弱。纤维化指标α-SMA、Collagen I、Collagen III表达显著上调。经过8周游泳训练后,SHR游泳组大鼠心肌组织PI3Kp110α、PPARα及SCAD蛋白表达水平明显上调,PI3K p110γ、p-ERK1/2、p-IκBα、p-p65蛋白表达水平显著下调。SHR游泳组SCAD酶活性升高,线粒体脂肪酸β氧化能力增强,心脏功能明显提高,心肌纤维化明显改善。2.与对照组相比,Ang II刺激CFs后,CFs增殖率及纤维化指标α-SMA、Collagen I、Collagen III表达显著升高,表明Ang II刺激CFs构建心肌纤维化细胞模型成功。PI3K p110α及SCAD显著下调,PI3K p110γ、p-ERK1/2、p-IκBα、p-p65蛋白显著上调。SCAD酶活性显著下调,线粒体脂肪酸β氧化能力减弱,其变化趋势与SHR心肌纤维化一致。3.与对照组相比,LPS组CFs增殖率及胶原分子m RNA与蛋白表达水平显著升高,p-p65表达显著上调,而SCAD表达明显下调,CFs能量代谢障碍明显;而Maslinic acid组能降低CFs纤维化指标表达水平及p-p65表达水平,引起SCAD表达上调,从而增强脂肪酸β氧化能力。与Ang II组相比,Ang II+LPS组无显著性差异;而给予Maslinic acid预处理后该组p-p65表达显著下调,SCAD表达和酶活性显著增加,脂肪酸β氧化水平明显提高,从而ATP生成增加,脂肪酸利用增加;而CFs增殖率及纤维化指标α-SMA、Collagen I、Collagen III表达水平明显降低。而与Ang II组相比,Ang II+LPS+Feno组p-p65表达不变,PPAR和SCAD表达显著上调,能量代谢障碍明显改善,CFs增殖率及胶原表达水平明显降低。4.与对照组相比,EGF组CFs增殖率及纤维化指标表达水平明显上调,p-ERK1/2、p-IκBα、p-p65蛋白表达显著上调,SCAD表达和酶活性显著下调,脂肪酸β氧化水平明显降低,细胞能量代谢障碍明显;PD98059组能显著下调CFs纤维化指标表达以及p-ERK1/2、p-IκBα、p-p65水平,SCAD表达显著上调,抑制CFs增殖,促进细胞能量代谢。与Ang II组相比,Ang II+EGF没有显著性差异;Ang II+PD98059组p-ERK1/2、p-IκBα、p-p65蛋白水平下调,SCAD表达和酶活性显著上调,ATP含量增加,游离脂肪酸摄取增加而含量减少,同时CFs增殖率明显降低,纤维化指标表达显著下调。而与Ang II组相比,Ang II+EGF+Maslinic acid组p-ERK1/2、p-IκBα表达不变,p-p65表达下调,引起SCAD表达上调,CFs能量代谢障碍明显改善。5.与对照组相比,A66组PI3K p110α表达明显下调,PI3K p110γ表达不变,p-ERK1/2、p-IκBα、p-p65表达明显上调,SCAD表达明显下调,A66处理CFs抑制PI3K p110α表达后引起CFs增殖率及其纤维化指标表达水平明显升高。与Ang II组相比,Ang II+AS605240组PI3K p110γ表达明显下调,p110α表达不变,p-ERK1/2、p-IκBα、p-p65蛋白表达明显下调,SCAD表达明显上调,CFs增殖率及纤维化指标表达水平明显降低。AS605240处理CFs后,通过抑制p110γ的表达,调节下游作用靶点,从而改善Ang II刺激导致的CFs能量代谢障碍。结论PI3K p110α/γ通过介导ERK1/2和NF-κB,从而调控PPARα、SCAD在心肌纤维化中的作用。PI3K/ERK1/2/NF-κB/PPARα/SCAD信号途径在心肌纤维化中起着重要的作用。