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应激对肿瘤的影响引起越来越多研究者的关注。流行病学调查发现应激与肿瘤的发生发展具有相关性,但缺乏应激对肿瘤作用及机制的实验室依据。本研究将在实验室前期研究的基础上,从恶性和良性应激入手,分别构建母婴分离(Maternal Separation,MS)恶性应激及丰富生存环境(Enriched Environment,EE)良性应激两种模型,探讨应激对肿瘤的调控作用及其相关分子机制。第一部分应激对小鼠肿瘤生长及转移的作用目的:探讨恶性应激对胰腺癌的生长影响和良性应激对黑色素瘤肺转移的作用。方法:1.恶性应激MS模型的构建:小鼠从出生后第一天至21天起,每天在10:00 am—16:00 pm时间内将新生C57BL/6小鼠和母鼠分开饲养6 h,对照组小鼠不做任何处理。断奶后,各组小鼠按照性别分组饲养至小鼠6周龄,然后用高架十字迷宫(Elevated Plus Maze,EPM)实验检测母婴分离是否改变小鼠焦虑行为;2.MS对胰腺癌生长的影响:行为学实验两天后,即小鼠6.5周龄时,向小鼠右侧皮下接种6×10~5个胰腺癌Panc02细胞,建立胰腺癌小鼠皮下移植瘤模型,每5天检测肿瘤生长状况,35天后处死小鼠获取皮下瘤并称重;3.良性应激EE模型的构建:将24只3周龄的C57BL/6雄性小鼠随机均分到丰富生存环境组(Enriched Environment,EE)和正常环境饲养组(Standard Environment,SE),其中丰富生存环境组小鼠12只一笼饲养在EE笼具,笼具中包括房屋、厕所、玩具等特色设施;12只SE组小鼠,每笼4只饲养在SE笼具,笼具中仅有垫料。饲养3周后,即小鼠6周龄时用高架十字迷宫检测各组小鼠行为学变化;4.EE对黑色素瘤肺转移的影响:行为学实验两天后,即小鼠6.5周龄时,通过尾静脉向各组小鼠注射1×10~5个黑色素瘤B16细胞,肿瘤接种21天后处死小鼠,并剥取肺组织,观察各组小鼠肺组织中黑色素瘤转移情况。结果:1.EPM检测指标包括开臂活动时间、活动路程百分比和第一次进入开臂等待时间,前两者和小鼠焦虑程度呈负相关,等待时间和小鼠焦虑程度呈正相关。21天后,EPM检测6周龄小鼠行为发现,MS组雄性小鼠在EPM中的活动时间为48.11±5.75 s,较对照组时间(81.27±6.71 s)明显减少(P<0.01);MS组活动路程百分比为13.63±1.98%,较对照组(20.93±1.84%)明显降低(P<0.05),而MS组小鼠第一次进入开放臂的等待时间为95.44±22.38 s,较对照组小鼠(32.46±4.79 s)明显延长(P<0.01),说明MS能导致成年后的雄性小鼠焦虑水平的增加,这也证实了恶性应激模型构建成功;2.在小鼠Panc02细胞皮下移植瘤中,肿瘤细胞接种35天后,母婴分离组中雄性小鼠较对照组雄性小鼠的肿瘤重量显著增加(0.56±0.09 g vs 0.36±0.04g,P<0.05),其增加幅度达到了56.8%,说明MS也能明显促进小鼠胰腺癌的生长(P<0.01);3.MS对成年后的雌性小鼠焦虑水平和小鼠胰腺癌的生长(P>0.05)影响较小;4.EE能够明显延长小鼠进入EPM开臂的活动时间、活动路程百分比,降低小鼠第一次进入开臂的等待时间,说明EE能降低小鼠的焦虑水平,良性应激模型构建成功;5.EE组小鼠较SE组雄性小鼠肺组织中转移的黑色素瘤结节明显增加,转移结节数目EE组较SE组减少43.58%,转移结节面积EE组较SE组减少76.54%。结论:生命早期恶性应激MS具有促进成年小鼠肿瘤生长的作用,且该作用可能存在性别差异,而丰富生存环境良性应激能够抑制小鼠恶性肿瘤的转移。第二部分应激调控的基因UQCRC1对胰腺癌的作用及机制研究目的:我们实验室前期的研究结果提示EE能够抑制胰腺癌的生长,同时下调线粒体相关基因UQCRC1在胰腺癌细胞中的表达水平,因此本研究的目的是探讨丰富生存环境下调基因UQCRC1对胰腺癌发展的作用及其机制。方法:1.Real Time-PCR(RT-PCR)及Western Blot验证UQCRC1基因在EE及SE小鼠胰腺癌组织中的表达情况;2.RT-PCR检测UQCRC1基因在四株人胰腺癌细胞株中的表达情况;3.体外过表达和下调UQCRC1基因,检测UQCRC1改变对细胞增殖、迁移及侵袭的影响;4.每只裸鼠皮下接种3.5×10~6个PANC-1-UQCRC1及PANC-Lv细胞,建立裸鼠皮下胰腺癌移植瘤,每5天检测肿瘤体积,持续8周。处死荷瘤裸鼠并取瘤称重;同时,每只裸鼠胰腺原位接种1.5×10~6个PANC-1-UQCRC1及PANC-Lv细胞,构建原位胰腺癌移植瘤模型,每周称取裸鼠体重,6周后处死裸鼠取瘤并称重;5.免疫组织化学染色检测UQCRC1基因在85对胰腺癌和癌旁组化芯片中的表达情况;6.人蛋白磷酸化芯片检测相关信号分子,并在过表达UQCRC1稳转株细胞中进行验证ERK1/2及p38α信号分子的磷酸化水平的改变,接着用ERK1/2磷酸化抑制剂SCH772984及p38α抑制剂BIRB796对细胞增殖的影响。结果:1.UQCRC1在EE胰腺癌组织中的表达水平较SE组明显降低的;2.RT-PCR检测UQCRC1基因在四株人胰腺癌细胞株中的表达结果显示,UQCRC1基因在ASPC-1,BXPC-3,CFPAC-1及PANC-1细胞中较正常胰腺导管细胞m RNA表达水平明显升高;3.UQCRC1能促进PANC-1及CFAPC-1细胞的增殖,同时流式细胞分析结果显示UQCRC1促进细胞增殖主要发生在细胞周期的G2/M+S期;随后,在PANC-1及CFPAC-1细胞中敲低UQCRC1基因后,细胞增殖的速度明显减慢;4.在裸鼠胰腺癌皮下移植瘤模型中,过表达UQCRC1的细胞皮下肿瘤生长速度明显快于阴性对照组,在裸鼠胰腺癌原位移植瘤中也观察到了过表达UQCRC1基因能够明显促进胰腺癌的生长;5.组化芯片结果显示,UQCRC1在胰腺癌组织中的表达水平明显高于对应癌旁组织,且85对组织点中,UQCRC1基因上调的有78例;临床病理资料分析显示,UQCRC1在胰腺癌组织中的表达水平和肿瘤病理分级呈正相关,而与患者的年龄和性别无关;6.随后的人蛋白磷酸化芯片结果显示,过表达UQCRC1基因能够促进ERK1/2及p38α磷酸化水平的增加,而使用ERK1/2磷酸化抑制剂SCH772984及p38α抑制剂BIRB796能分别抑制UQCRC1促进胰腺癌细胞的增殖作用。结论:应激调控的基因UQCRC1可能通过增加ERK1/2磷酸化水平促进胰腺癌的生长。