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实验背景：
尽管过去几十年中心血管疾病的预防和治疗都取得了巨大的进步，心肌梗死仍然是全球致死和致残的主要病因。心肌梗死后左心室壁结构、生理和神经体液各方面的变化，统称为左心室重构，是心肌梗死后自身修复的重要事件。适当的重构帮助保留残余心功能，而重构不良往往提示预后较差。左心室重构过程有许多因素的参与，如炎症反应、血流动力学负荷、神经体液激活、细胞因子生成和细胞外基质(extracellular matrix，ECM)转换。ECM的转换包括基质蛋白的降解与合成，通常需要多种蛋白酶参与，如基质金属蛋白酶家族(matrix metalloproteinases，MMPs)及其组织抑制剂(tissue inhibitors of metalloproteinases，TLMPs)的动态平衡影响着ECM的成分。除外MMPs，其他的蛋白酶也被证明参与降解ECM，如溶酶体半胱氨酸蛋白酶cathepsins在动脉粥样硬化、动脉瘤等动脉性疾病的ECM转换中起着重要作用。然而，cathepsins在心梗后左室重构过程中的作用尚未明了。
实验目的：
研究半胱氨酸蛋白酶cathepsins是否参与心梗后左室重构过程，并探讨cathepsins调节心梗后左室重构过程的可能机制。
实验方法：
通过永久性结扎冠状动脉左前降支建立小鼠心肌梗死模型，假手术组仅穿线不结扎。在心梗后1、2、3、7和28天收集梗死区和非梗死区的心肌组织，用实时荧光定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR)检测半胱氨酸蛋白酶cathepsins的mRNA表达水平，用生物素偶联的JPM探针标测cathepsins活性末端了解其活性变化。为进一步了解cathepsins在心梗后左室重构中的作用，在心梗前12小时至梗死后7天每天腹腔注射非选择性cathepsin抑制剂E64d或空白对照Vehicle。通过小动物超声心动图检测心梗前、梗死后7天及28天的小鼠左心室内径及心功能。在心梗后7天和28天处死小鼠，通过免疫组化染色和qPCR观察E64d抑制cathepsins对于心梗后炎症反应、纤维化、细胞凋亡和血管新生的影响，并用心肌组织裂解液明胶酶谱检测抑制cathepsins后的MMPs变化。行免疫组化染色、Western Blot和qPCR了解cathepsins在心脏成纤维细胞(cardiac fibroblast，CF)转分化为心肌成纤维细胞中的作用，并用转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)诱导体外原代培养的CF转分化模型验证非选择性抑制cathepsins、选择性抑制CathepsinS(CatS)和敲除CatS对于CF转分化的影响。为进一步明确CatS的作用，选用CatS基因敲除Ctss-/-小鼠建立心肌梗死模型，观察Ctss-/-小鼠心梗后纤维化程度及CF转分化情况，并通过免疫组化染色和WesternBlot研究CatS对于ED-A片段纤维连接蛋白表达和Smad2、Smad3磷酸化的影响。
实验结果：
心梗后梗死区与非梗死区cathepsins的表达和活性都出现变化，其中梗死区CatS的mRNA表达增加最明显，在心梗后7天达到顶峰(>30倍)，而且其活性也在心梗后7天最高。非选择性cathepsin抑制剂E64d处理进一步加重了小鼠心梗后7天和28天的左室扩张和心功能不全。病理学染色显示E64d处理增加了心梗后炎症细胞浸润和促炎症因子表达，影响了梗死区和非梗死区胶原蛋白和纤维连接蛋白的沉积与合成，尤其是抑制了介导TGF-β1信号通路的Smad2和Smad3的磷酸化激活，减少了额外结构域A(extradomainA，ED-A)片段纤维连接蛋白的表达，从而减少α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)的表达即CF向心肌成纤维细胞的转分化，但不影响梗死面积、细胞凋亡和血管新生。选择性抑制CatS或者敲除CatS基因也抑制了Smad2和Smad3的磷酸化，减少了ED-A片段纤维连接蛋白的表达，在体内体外都抑制了α-SMA的表达即CF向心肌成纤维细胞的转分化，最终导致胶原转换紊乱、左心室腔进一步扩大、心功能进一步恶化，类似于注射E64d的表现。冠状动脉粥样硬化性心脏病患者(coronary heart disease，CHD)血浆中的成熟CatS水平显著高于非冠状动脉粥样硬化性心脏病患者。
实验结论：
Cathepsins是调节心肌梗死后左心室重构过程，尤其是ECM转换的重要因素之一。CatS在小鼠心肌梗死模型中通过影响TGF-β1信号通路和ED-A片段纤维连接蛋白的表达，促进心肌成纤维细胞转分化限制左心室不良重构，保护左心室功能。