背景:卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤之一,因其起病隐匿,进展迅速,病死率居于妇科恶性肿瘤之首。尽管手术水平和放化疗方案有了很大提高,但由于高复发率和高耐药特性,其5年生存率并无显著改善。因此探索新的卵巢癌治疗方案是当下亟待研究的课题。WEE1蛋白激酶是细胞分裂周期中保证细胞遗传学完整性的重要的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。文献报道WEE1高表达于多种肿瘤细胞包括卵巢癌,黑色素瘤,骨肉瘤,乳腺癌等,尤其与化疗后卵巢癌患者的预后不良存在明显的相关系,提示WEE1可以作为卵巢癌治疗的一个新靶点。目的:研究WEE1抑制剂MK1775单药直接作用于卵巢癌细胞所致的体内外抗肿瘤效应;检测WEE1在不同免疫细胞亚型中的表达水平;探讨MK1775对肿瘤免疫微环境抗肿瘤免疫应答的调节作用及机制;为MK1775在卵巢癌治疗中的应用提供理论基础。第一部分 WEE1抑制剂MK1775对卵巢癌细胞的体外杀伤作用方法:1.RT-PCR检测WEE1 mRNA在卵巢癌细胞中的表达。2.MTT法检测WEE1抑制剂MK1775对卵巢癌细胞株ID8和SKOV3细胞活力的抑制作用。3.Annexin v/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒检测MK1775对ID8和SKOV3细胞凋亡的影响作用。4.Western Blot检测MK1775作用后pCDC2在卵巢癌细胞中的表达水平。5.PI和DAPI染色法检测MK1775对于卵巢癌细胞株ID8和SKOV3细胞周期的影响。结果:1.WEE1在卵巢癌细胞ID8中的表达:以GAPDH作为内参,以小鼠黑色素瘤B16作为对照,WEE1 mRNA在ID8细胞中表达的相对量显著高于其在对照组B16细胞中的相对量。2.WEE1抑制剂MK1775体抑制卵巢癌ID8和SKOV3细胞的活性,且呈浓度依赖性。MK1775在ID8细胞中的IC50值为750±196.33nM,在SKOV3细胞中的IC50值为464.7±127.71nM。3.WEE1抑制剂MK1775体外诱导卵巢癌细胞的凋亡:当给药浓度是0.5μM时,给药24小时组中ID8细胞的早期凋亡率并无统计学意义（P24h=0.9354）,48小时组ID8细胞的早期凋亡率显著升高（P48h=0.0489）,SKOV3细胞在24小时给药组和48小时给药组早期凋亡率均有显著升高。（P24h=0.0112,P48h=0.0006）。当给药浓度是1μM时,无论是24小时给药组或48小时给药组,MK1775均能显著诱导ID8细胞（P24h=0.0229,P48h=0.0398）和SKOV3细胞的早期凋亡（P24h=0.0011,P48h＜0.0001）。4.MK1775作用能显著下调ID8细胞和SKOV3细胞中周期蛋白依赖性激酶1（CDK1/CDC2）的磷酸化水平。5.MK1775对细胞周期的影响:MK1775作用后,ID8细胞中sub-G1的比例在0.5μM给药组（p＜0.0001）和1μM给药组（p＜0.0001）均高于对照组;G1期的比率在0.5μM给药组（p=0.0006）和1μM给药组（p＜0.0001）均低于对照组;S期的比率在0.5μM给药组（p=0.0012）和1μM给药组（p＜0.0001）显著高于对照组。G2-M期比率在0.5μM给药组（p=0.0055）和1μM给药组（p=0.0007）显著低于对照组。MK1775作用后,SKOV3的细胞周期产生了与ID8相似的变化,且变化更加显著。小结:1.WEE1抑制剂MK1775具有体外抗卵巢癌效应,且呈浓度依赖性。2.WEE1抑制剂MK1775通过抑制CDC2的磷酸化,损伤G2-M调控点的调控,抑制DNA修复,破坏正常细胞周期进行。3.MTT和细胞凋亡分析结果提示:MK1775对于p53野生型的ID8卵巢癌细胞和p53突变型的SKOV3卵巢癌细胞均具有细胞毒性。第二部分 WEE1在不同免疫细胞亚型以及不同肿瘤细胞中的表达水平及对比方法:1.应用T细胞、B细胞、CD11b+细胞分选试剂盒分选出WT小鼠脾脏中不同亚型的免疫细胞。2.RT-PCR检测T细胞、B细胞、CD11b+细胞等不同亚型的免疫细胞中以及不同肿瘤细胞中WEE1 mRNA的表达水平。3.RT-PCR检测CD4+T细胞、CD8+T细胞、Treg细胞等不同亚型的T细胞中WEE1的表达水平。结果:1.通过分选获得了 WT小鼠的T细胞、B细胞、CD11b+细胞;同时筛选获得不同亚型的T细胞,包括CD4+T细胞、CD8+T细胞、Treg细胞。2.以T细胞、B细胞、CD11b+细胞作为免疫细胞组整体分析时,WEE1在免疫细胞组中的表达水平显著高于在肿瘤细胞组中的表达（p＜0.0001）。两两相互比较时,WEE1在T细胞、B细胞、CD11b+细胞中的表达均无显著性差异（p＞0.05）。3.两两比较时,不同亚型的T淋巴细胞（初始CD4+T细胞、初始CD8+T细胞、Treg细胞）中WEE1的表达水平均无显著性差异（p＞0.05）。小结:1.WEE1同时表达于免疫细胞和肿瘤细胞中,提示MK1775不但作用于肿瘤细胞,而且可能影响免疫细胞的免疫反应。2.WEE1在小鼠不同亚型的免疫细胞中的表达显著高于其在小鼠肿瘤细胞中的表达水平。第三部分MK1775在小鼠卵巢癌模型中的抗肿瘤活性及其对肿瘤免疫微环境中T淋巴细胞亚群分布的影响方法:1.应用C57BL/6 WT小鼠建立ID8-luciferase卵巢癌模型。2.待成瘤后随机分组,MK1775或DMSO连续腹腔给药30天。检测小鼠的体重曲线、腹围曲线,并于终止给药时检测荷瘤小鼠恶性腹水生成量。3.流式细胞术检测荷瘤小鼠卵巢癌组织及恶性腹水中T细胞不同亚型的比例。4.流式细胞术检测荷瘤小鼠脾脏中T细胞不同亚型的分布比例。结果:1.IVIS小鼠活体成像结果提示成功建立了小鼠ID8卵巢癌模型。2.给药组小鼠和对照组小鼠的体重对比（p=0.0182）、腹围对比（p=0.0291）均间接证明了 MK1775能显著抑制ID8卵巢癌小鼠中恶性腹水的生成。终止给药后直接检测荷瘤小鼠腹水生成量,给药组显著低于对照组（p=0.0172）。3.与对照组相比,给药组腹水中CD8+/CD4+T细胞的比率显著增加（p=0.004）;而CD4+T细胞的绝对值有降低的趋势（p=0.1188）。与对照组相比,给药组卵巢癌组织中CD8+/CD4+T细胞的比率有上升的趋势,但无统计学差异（p=0.1136）;卵巢癌组织中CD4+T细胞的绝对值明显减少（p=0.0497）。4.与对照组相比较,给药组小鼠脾脏中CD4+T细胞（p=0.0172）和Treg细胞的绝对值均明显降低（p=0.0209）。小结:1.MK1775具有显著的体内抗卵巢癌效应。2.MK1775除直接作用于卵巢癌细胞外,还可通过增加肿瘤微环境中CD8+/CD4+T细胞的比率、降低Treg细胞的数量来调节肿瘤微环境中免疫系统的抗肿瘤免疫应答。第四部分MK1775发挥抗肿瘤免疫调节作用的机制方法:1.流式细胞术检测MK1775作用后CD4+T细胞、CD8+T细胞和Treg细胞中CDC2的磷酸化水平。2.应用 Cell Proliferation Dye eFluor?450 染色的方法分析 MK1775 对 CD4+T细胞、CD8+T细胞增殖的影响。3.体外诱导分化和培养Treg细胞检测MK1775对Treg细胞分化和增殖的影响。4.流式细胞术检测MK1775作用后Treg细胞中CD69、CD44和CD95的表达水平,cleaved-caspase 3染色分析MK1775对Treg细胞凋亡的影响。结果:1.与对照组相比,MK1775作用后CD4+T细胞（p＜0.0001）、CD8+T细胞（p＜0.0001）和Treg细胞（p＜0.0001）中CDC2的磷酸化水平均有显著降低。2.MK1775抑制CD4+T细胞和CD8+T细胞的增殖,CD8+T细胞（p=0.0286）相对于CD4+T细胞（p=0.0006）对于MK1775的作用相对耐受。在最高给药浓度0.5μM MK1775作用时,CD4+T细胞增殖的百分比相较于阳性对照组降低了54.7±2.982%;CD8+T细胞增殖的百分比相较于阳性对照组仅降低了 7.933±0.569%。3.MK1775抑制Treg细胞的体外诱导分化,抑制效应为浓度依赖性（r=-0.9116,P=0.0311）。MK1775抑制Treg细胞的体外增殖,抑制效应为浓度依赖性（r=-0.9826,P=0.0028）。。4.相较于 DMSO 作用组,MK1775 作用后 Treg 中 CD69（p=0.0215）、CD44（p=0.0006）和CD95（p=0.0001）的表达水平均显著提高。相较于DMSO作用组,0.1μM MK1775能显著增加Treg细胞中caspase 3的表达,提示MK1775可诱导iTreg细胞的凋亡（p=0.016）。小结:1.MK1775可抑制CD4+T、CD8+和Treg细胞的增殖,CD8+T细胞对于MK1775作用的相对耐受。2.MK1775浓度依赖性的抑制Treg的体外诱导分化。3.MK1775作用后Treg细胞中CD69、CD44和CD95的高表达以及caspase 3的高表达提示活化诱导的细胞凋亡（activation-induced cell death,AICD）可能也是MK1775降低Treg细胞数量的机制之一。结论1.MK1775单药作用具有体外和体内卵巢癌杀伤效应。2.MK1775通过抑制CD4+T细胞、CD8+T细胞、Treg细胞的增殖、抑制Treg细胞分化并诱导其凋亡等途径来改变不同亚型的T细胞的分布比例。3.MK1775除直接作用于卵巢癌细胞发挥杀伤作用外,还可能调节肿瘤免疫微环境,上调机体的抵抗肿瘤免疫应答。4.实验结果为MK1775在卵巢癌化疗免疫治疗中的应用提供了证据支持。