论文部分内容阅读
细胞凋亡是细胞响应内外环境信号后为了维持生命体内稳态而做出的自杀行为。细胞凋亡在有机体的生长发育过程中扮演着重要的角色,它所涉及的主要调控基因的突变也在多种疾病如癌症、神经系统疾病等的发病过程中具有不可推卸的责任。DNA甲基化在许多生物过程和癌症发生中起着至关重要的作用。氮杂胞苷5-azacytidine（5-AC）是一种DNA甲基化抑制剂,在临床上已被用来治疗骨髓增生异常综合征、白血病等疾病。实验室前期研究发现5-AC能够特异性抑制凋亡过程,但其中涉及到的分子途径还需要进一步探索。核仁是负责核糖体生物合成的核细胞器,近期研究和核仁蛋白组学的发展表明其在多种生命活动中发挥着重要的作用。核仁的结构是其正常发挥生物学功能的体现。凋亡细胞染色质凝聚,核仁破碎。研究表明组蛋白H3第9位上赖氨酸的二甲基化修饰H3K9me2是核仁维持结构完整性不可缺少的部分,然而其对核仁结构的分子调控机理还有待于进一步的探究。本论文对细胞凋亡和核仁结构的表观调控机制进行了研究,主要结果如下:1、DNA甲基化抑制剂5-AC通过影响抗凋亡蛋白BCL-XL特异性抑制肿瘤坏死因子TNF-α和放线菌酮cycloheximide（CHX）共同诱导的NIH-3T3细胞的凋亡5-AC的处理会使癌细胞整体基因组甲基化包括特定凋亡基因的启动子甲基化水平降低,从而引起癌细胞的凋亡。由于细胞内分子环境之间的差异,不同的细胞类型对5-AC的刺激具有不一样的反应。实验室前期研究发现小鼠胚胎成纤维细胞系NIH-3T3对5-AC具有很高的耐受度,并且在TNF-α和CHX共同诱导的NIH-3T3细胞凋亡过程中基因组甲基化会有明显的升高,而50μmol/l的5-AC预处理3 h会显著阻滞该凋亡过程。为了进一步探究DNA甲基化在NIH-3T3细胞凋亡过程中发挥的作用,我对比使用了另外三种DNA甲基化抑制剂5-aza-2’-deoxycytidine（5-d AC）、6-thioguanine（6-TG）和RG108。Dot blot结果表明这三种甲基化抑制剂的预处理可以像5-AC一样使NIH-3T3细胞的整体基因组甲基化降低到了正常水平。但是Annexin-V-FITC和PI共染后进行流式（FCM）细胞凋亡检测的结果却表明它们却不能像5-AC一样表现出抑制TNF-α和CHX共同诱导的NIH-3T3细胞凋亡的作用。进一步使用小干扰RNA（siRNA）将DNA甲基转移酶DNMT1瞬时敲低以达到降低基因组甲基化的目的。然而FCM细胞凋亡检测数据表明DNMT1的敲低基本上不影响NIH-3T3细胞的凋亡过程。综合以上结果,我认为5-AC特异性抑制TNF-α和CHX诱导的NIH-3T3细胞凋亡过程,但是是以DNA甲基化非依赖性的方式。随后我用western blot技术检测细胞凋亡相关的BCL-2家族中抗凋亡蛋白BCL-XL、BCL-2及促凋亡蛋白BAX在该凋亡过程中的变化,结果表明三种蛋白在该过程中都被下调。而且FCM细胞凋亡检测数据表明siRNA介导的抗凋亡蛋白BCL-XL的敲低会废除5-AC抑制凋亡的作用。另一方面,对抗凋亡蛋白BCL-2或促凋亡蛋白BAX的敲低则不会干扰5-AC的抑制作用。这些数据表明5-AC通过影响抗凋亡蛋白BCL-XL来发挥抑制TNF-α和CHX诱导的NIH-3T3细胞凋亡的作用。2、rDNA位点上的H3K9me2水平的降低诱导rDNA转录起始的增加和核仁分散现象在该研究中,我分析了三种rRNA polymerase I转录抑制剂ActD、BMH21或CX5461分别处理人类肺癌A549细胞24 h后对该细胞的影响。我通过核仁标记物纤维蛋白fibrillarin（FC）的荧光免疫（IF）染色检测到含有超过3个核仁的间期细胞核数量发生显著性的增加。以rDNA基因编码区5’端引物进行实时定量PCR（q RT-PCR）,结果显示以45S pre-rRNA（45S pre）作为指示的rDNA转录起始产物的数量也发生显著上升的趋势。在人类宫颈癌HeLa细胞中也观察到了类似的现象。染色质免疫共沉淀（ChIP）实验表明HeLa细胞rDNA位点上的异染色质标记H3K9me2水平明显降低。使用ActD对HeLa细胞进行时间梯度的处理,包括10 min、20 min、30 min和1 h,IF染色实验结果表明在处理20 min后,含有超过三个核仁的HeLa间期细胞核数量才发生显著性上升,q RT-PCR结果表明rDNA的转录起始的水平也在处理20 min后开始增加。然而ChIP实验表明在ActD处理10 min后,rDNA位点的H3K9me2水平已经明显降低,表明rDNA位点的组蛋白修饰H3K9me2先于rDNA转录起始和核仁数量增多,并且rDNA的转录起始与核仁分散之间有着密切的联系。BIX-01294（BIX）能够特异性抑制组蛋白赖氨酸甲基化转移酶G9a的活性并减少基因组水平上H3K9me2的数量。用BIX处理HeLa细胞后进行ChIP实验,结果表明rDNA位点H3K9me2的整体水平显著降低。IF染色实验及其统计数据表明BIX的处理也会导致显著的间期细胞核核仁数目的增多,q RT-PCR结果显示rDNA的转录起始产物45S pre的表达量也有显著的升高。这些数据表明HeLa细胞rDNA位点上的H3K9me2能够调控rDNA的转录起始以及核仁结构的完整性。3、HeLa细胞rDNA位点上R-loop的积累导致核仁分散我使用抗RNA:DNA杂交体即R-loop的抗体S9.6对ActD处理的HeLa细胞进行ChIP实验分析,发现经过不同时间的转录抑制剂处理后,HeLa细胞rDNA位点上R-loop的数量都表现出显著增高的趋势。核糖核酸酶H1（RNase H1）能够特异性降解基因组中的R-loop。我利用siRNA将HeLa细胞中的RNase H1瞬时敲低来探究R-loop在核仁分散现象中的作用。RNase H1敲低后的ChIP实验数据表明rDNA位点上的R-loop数量明显增加,并且IF染色实验的统计数据表明敲低后的HeLa细胞中也出现了数量显著的核仁增多的间期细胞核。构建过表达RNase H1的载体并瞬时转染HeLa细胞能够显著减弱ActD带来的核仁分散的影响。这些数据表明,HeLa细胞中rDNA位点上R-loop的数量能够调控核仁结构,R-loop数量过多时会使细胞核仁数目增多,造成核仁分散的现象。4、HeLa细胞rDNA位点上的R-loop受到该位点H3K9me2的调控ChIP数据表明,RNase H1的敲低会使HeLa细胞rDNA位点上的R-loop升高,但是该位点上的H3K9me2的数量基本保持不变。而BIX的处理则会使HeLa细胞rDNA位点上H3K9me2的整体水平降低,同时促使该位点R-loop的数量增多。这些数据表明HeLa细胞中rDNA位点上的H3K9me2调控R-loop的水平,并且两者都参与调控核仁结构的完整性。