目的：帕金森病(Parkinson’s disease，PD)主要以中脑黑质内多巴胺能神经元进行性变性丧失为特征，是一种好发于中老年人常见的缓慢进展性神经系统变性疾病，发病率在神经变性疾病中处于第二位，而且发病率随着年龄增长而逐渐增高，65岁以上的老年人中，发病率占到1％～3％。当纹状体内多巴胺水平减少70％～80％，中脑黑质多巴胺能神经元变性超过50％时，导致锥体外系运动功能障碍，如出现静止性震颤、强直、运动过缓和姿势不稳等表现。关于PD的病因与发病机制研究目前仍不十分清楚，目前主要存在以下几种观点：遗传因素、环境因素、兴奋性神经毒以及钙的细胞毒作用、氧化应激、年龄老化、线粒体损伤、细胞凋亡和免疫学异常。近几年，随着研究的深入，免疫方面的异常日渐受到学者的关注。Mattila等报道PD病人免疫学特征是细胞免疫功能异常，淋巴细胞亚群比值发生改变。Fiszer等报道PD病人细胞免疫功能降低，尤以IL-1活性降低最为明显，体液免疫中IgA、IgM增高，IgG无变化。研究发现，PD患者外周血T细胞中高亲和力的IFN-γ受体显著低于健康人，TNF-α受体高于健康人，这些均说明PD患者免疫网络发生了紊乱。目前临床上PD的治疗尚无特效的手段，其总体原则依旧是早期在于减轻症状并保持自理能力，晚期则是最大限度延长开期，缩短关期，同时处理药物引起的并发症、症状波动和精神障碍。而且无论是药物治疗还是手术治疗都不能阻止DA能神经元的持续丢失，也不能防止PD患者临床症状的进行性加重。针灸作为一种独特、安全的自然疗法，在PD的治疗中越来越发挥着重要的作用，本课题拟探讨“双固一通”针法对PD模型大鼠免疫功能调节的作用机制，为针灸治疗PD提供新的思路和方法。研究显示，几乎所有的中枢神经系统变性疾病中小胶质细胞均有可能参与到发生、发展的各个阶段，但在PD的发展中小胶质细胞的激活具有更加重要的意义。首先，氧自由基损伤在多巴胺能神经元损伤中具有决定意义，而小胶质细胞的激活是大量自由基产生的主要来源，其次，组织学研究表明中脑黑质区是小胶质细胞最富集的区域。在PD患者脑脊液中，伴随着中脑黑质致密部DA能神经元选择性丧失的是大量表达人类白细胞抗原(HLA)DR的小胶质细胞的激活，DA能神经元的丧失程度与小胶质细胞激活呈平行关系。小胶质细胞激活后所释放的前炎症细胞因子和过量的自由基介导了DA能神经元的损伤，因此只要能抑制小胶质细胞激活，就能最大限度的减少DA能神经元的丢失。近年来，传统中医药疗法治疗PD的研究取得了一定的进展，尤其是针灸作为一种独特、安全、方便的治疗方法已经越来越多地运用于临床，取得了较为肯定的疗效。毫针、头针、电针等常用的针灸法用于帕金森氏病的治疗，针灸可以对肌电位产生影响、调整抗氧化酶系统，提高脑内多胺水平及对免疫因子成分产生影响。但有关针灸治疗PD作用机制的深入研究甚少。我们在前期工作中，导师王华教授根据祖国医学理论，认为肝风内动是本病的主要病机，主病在肝，病位在脑，确定了通调脑络，熄风止颤，柔肝舒筋的治疗原则，根据“双固一通”针灸法的指导思想，选取关元、足三里、太冲、风府四穴，对PD模型大鼠施以电针治疗，发现针刺可使PD大鼠中脑黑质TH活性增强，大脑皮质一氧化氮合酶(NOS)表达降低，纹状体谷氨酸(Glu)含量下降，胶质细胞系源性神经营养因子(GDNF)表达增强，并观察了黑质神经元的超微病理改变。本课题拟在前期工作的基础上，建立早中期PD大鼠模型，采用免疫学和分子生物学实验方法，从细胞免疫、体液免疫、免疫调控等方面入手，在细胞和分子水平阐明针刺治疗对帕金森病免疫功能的调节作用，从而为揭示针刺治疗帕金森病的作用机制提供实验依据，并为临床治疗提供指导作用。方法：1．建立早中期偏侧PD大鼠模型：SD大鼠80只，随机分为4组：正常对照组，假手术组，模型组，“双固一通”组。在鼠脑立体定位仪上，将6-OH DA(10μg/5μL)注入大鼠一侧纹状体尾壳核(CPU)，1周后以阿朴吗啡(apomorphine)腹腔注射(0.5mg/kg体重)诱发旋转行为，40min内平均转速超过7r/min者为造模成功。2．“双固一通”针刺治疗方法：取关元、足三里、太冲、风府，30号毫针，接G6805电针治疗仪，采用连续波，频率为120次/分，每天1次，每次30分钟，连续治疗30天后取材。4组动物同步。3．“双固一通”针法对早中期PD模型大鼠中脑黑质区小胶质细胞形态及含量的影响，采用蓖麻凝集素标记小胶质细胞；免疫组织化学染色。4．“双固一通”针法对早中期PD模型大鼠中脑黑质HLA-DR表达的影响；运用PCR和Western blot技术测定HLA-DR表达水平。5．“双固一通”针法对早中期PD模型大鼠细胞因子IFN-γ受体以及TNF-α受体的影响；运用抗细胞因子受体单克隆抗体测定法测定IFN-γ受体以及TNF-α受体含量。6．“双固一通”针法对早中期PD模型大鼠IL-1活性的影响，采用免疫组化方法。7．“双固一通”针法对早中期PD模型大鼠黑质细胞凋亡的影响，TH细胞流式细胞仪检测细胞凋亡和PCR方法检测Bax和Bcl-2基因表达。结果：1．模型组损毁侧黑质致密部神经元总数、TH阳性神经元数量及纹状体TH阳性神经纤维数量显著低于正常组和假手术组(P＜0.01)，“双固一通”组与模型组比较各相应指标数值均显著增加(P＜0.01)；正常对照组组和假手术组几乎未见RCA阳性小胶质细胞，而“双固一通”组的小胶质细胞数量与同时间段的模型组小胶质细胞数量相比均有降低(P＜0.05)。2．PCR方法检测HLA-DRA，HLA-DRB1，4在模型组表达明显高于正常对照组，假手术组和“双固一通”组，用电针治疗后，HLA-DRA，HLA-DRB1，4明显降低，而HLA-DRB3，5却无此变化；HLA-DRA，HLA-DRB1，3，5蛋白在模型组表达明显高于正常对照组组，假手术组和“双固一通”组。用电针治疗后，明显降低，与PCR结果有点不同的是只有HLA-DRB4无此变化。3．与帕金森模型组，正常对照组和假手术组相比较，“双固一通”组大鼠血清中TNF-αR和IFN-γR含量明显降低(P＜0.01)。4．帕金森模型组大鼠IL-1β的表达明显高于“双固一通”治疗组、正常对照组和假手术组(P＜0.05)，电针治疗后IL-1β的表达明显低于模型组。5．模型组黑质凋亡细胞比率最高，与其它组比较均有极显著性差异性(P＜0.01)。“双固一通”组黑质细胞凋亡率虽然低于模型组，但仍高于正常组和假手术组，有显著性差异性(P＜0.01)。6．Bax mRNA在模型组的黑质、纹状体内表达均有所下降，尤其在黑质内的表达与对照组比有显著性差异(P＜0.05)，“双固一通”组Bax mRNA的表达增高，与模型组相比(P＜0.05)；相对于Bax，模型组的Bcl-2 mRNA只在黑质中表达显著低于对照组(P＜0.05)，“双固一通”组则与Bax相似。结论：1．帕金森模型组中存在免疫异常，可以引起TNF-α，IFN-γ，IL-1β和HLA-DR的变化。2．帕金森病存在着小胶质细胞数量变化。3．模型组黑质细胞凋亡比率也增高。4．电针可以调节PD模型大鼠的免疫功能，增加小胶质细胞数量，抑制细胞凋亡进程，实验表明“双固一通”针法是治疗PD的一种较为可靠的方法。