【摘 要】
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H6亚型禽流感病毒感染宿主范围非常广,在北美洲和亚洲鸟群中普遍存在,也是我国南方地区家禽和水禽常见的禽流感病毒亚型之一。我国自2000年以来在家禽中已有分离到H6亚型禽流感病毒的报道,其流行和传播呈上升趋势,导致H6亚型禽流感病毒与其他亚型禽流感病毒发生交流的可能性大大增加。与此同时,大量使用疫苗或药物预防禽流感病毒在禽类中发生并传播以及病毒存活环境的变化,均可能导致病毒发生基因突变。从而改变其生
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H6亚型禽流感病毒感染宿主范围非常广,在北美洲和亚洲鸟群中普遍存在,也是我国南方地区家禽和水禽常见的禽流感病毒亚型之一。我国自2000年以来在家禽中已有分离到H6亚型禽流感病毒的报道,其流行和传播呈上升趋势,导致H6亚型禽流感病毒与其他亚型禽流感病毒发生交流的可能性大大增加。与此同时,大量使用疫苗或药物预防禽流感病毒在禽类中发生并传播以及病毒存活环境的变化,均可能导致病毒发生基因突变。从而改变其生物学特性,这对禽类养殖经济和广大公共环境卫生带来极大的威胁。所以,对我国H6亚型禽流感病毒进行全基因组遗传演化分析和生物学特性的研究具有重要意义。本研究主要收集了广东省多个地区活禽交易市场分离所得的H6亚型禽流感病毒,综合国内报道的H6亚型禽流感病毒流行病学调查研究结果和获取分离株的地区和时间情况,筛选出92株2014年~2017年的病毒分离株。并对其进行遗传进化分析及致病性研究。其中包括了48株H6N2亚型禽流感病毒和44株H6N6亚型禽流感病毒。病毒分离与鉴定结果显示,分离所得的H6N2亚型禽流感病毒毒株,有5株来自于鸡只,其余毒株均从水禽中分离所得;H6N6亚型禽流感病毒毒株,有2株病毒分离于鸽子,3株从环境中分离所得,5株从鸡中分离所得,其余毒株均从水禽中分离所得。92株毒株的HA氨基酸裂解位点附近序列均为PQIETR↓GLF,符合低致病性禽流感病毒的典型分子标志。H6N2亚型禽流感病毒分离株编码HA蛋白的氨基酸,其位点对应H3亚型禽流感病毒序列位置为155位和190位分别有21株和25株毒株发生了变异。而H6N6亚型禽流感病毒分离株中有3株毒株发生编码HA蛋白的氨基酸138位突变。另外,H6N2亚型禽流感病毒分离株中,有7株毒株编码NA蛋白的氨基酸片段发生了单个潜在糖基化位点缺失,另外有3株毒株发生了单个潜在糖基化位点插入。H6N6亚型禽流感病毒分离株中,有4株毒株的编码NA蛋白的氨基酸片段发生了单个潜在糖基化位点的缺失。根据对病毒HA和NA基因信息,从首次筛选的毒株中选出20株H6N2亚型禽流感病毒毒株和20株H6N6亚型禽流感病毒毒株,并对其进行全基因信息获取与分析。所有分离毒株除编码病毒外部蛋白的氨基酸片段外,其余6个编码病毒蛋白的氨基酸片段均没有发生关键位点的突变和氨基酸数量的变化。根据观察病毒8个不同基因片段的在其遗传进化树上的位置,可总结出所分离的H6N2亚型禽流感病毒共有7种不同的基因型组合,H6N6亚型禽流感病毒共有10种不同的基因型组合,符合中国南方地区H6亚型禽流感病毒基因组合类型繁多的实际情况。经过对病毒基因信息分析,筛选出两株H6N2亚型禽流感病毒毒株和两株H6N6亚型禽流感病毒毒株,其病毒名称分别为A/chicken/Heyuan/d752/2016(H6N2)、A/g oose/Guangdong/e488/2017(H6N2)、A/pigeon/Panyu/d9/2016(H6N6)和A/duck/Gua ngzhou/e168/2017(H6N6)。以106EID50/200μL病毒剂量分别以滴鼻和点眼的方式感染SPF鸡,以滴鼻的方式感染BALB/c小鼠。实验结果发现毒株感染SPF鸡和BALB/c小鼠后引起攻毒动物血清的抗体转阳,并从实验动物的肺部及气管等组织器官研磨液中检出不同程度的病毒含量。毒株A/goose/Guangdong/e488/2017(H6N2)只能在攻毒组实验鸡的气管内明显复制,病毒滴度为3.75±0.5 log10EID50/200μL。毒株A/p igeon/Panyu/d9/2016(H6N6)只能在攻毒组实验鸡的肺部检测出明显的病毒滴度,滴度为3.25 log10EID50/200μL。在对SPF鸡感染实验中,除e168-H6N6实验组外,其余病毒实验组可以使同居组动物发生感染。而在小鼠实验中,H6N2亚型禽流感病毒攻毒组对小鼠体重的影响力明显大于H6N6亚型禽流感病毒攻毒组,但二者均存在对小鼠此类哺乳类动物造成感染和明显的体重变化。
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