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慢性脑缺血(chronic cerebral hypoperfusion,CCH)是一种临床常见的脑缺血损伤,是血管性痴呆、阿尔茨海默症和Binswanger病等多种神经系统疾病或精神疾病发生发展过程中的病理因素。研究表明,长期脑血流灌注不足导致能量代谢障碍、氧化应激产生及炎性因子释放,神经细胞凋亡,进而造成了认知功能受损。研究表明,慢性脑缺血后,抑制氧化应激,促进血管新生,建立有效的侧支循环是改善全脑及局部脑组织低灌注,减轻神经功能损伤的有效方法。白藜芦醇是一类植物抗毒素,属于天然的多酚类,具有抗炎、抗氧化、抗糖尿病和心肌保护等一系列的保护作用。研究表明,白藜芦醇通过减轻氧化应激来保护氧化损伤的大脑神经,并对阿尔茨海默症小鼠的认知功能有一定的改善作用,但其是否对慢性脑缺血性认知功能损伤有所改善仍不明确。本研究拟建立CCH大鼠模型,给予白藜芦醇治疗,探索白藜芦醇对CCH大鼠认知功能的改善作用,分别从自噬流和血管再生两个层面探讨其作用机制。1.白藜芦醇改善慢性脑缺血性认知功能障碍目的:探讨白藜芦醇对慢性脑缺血认知功能障碍的保护作用。方法:SD大鼠随机分为假手术组(Sham组)、慢性脑低灌注模型组(CCH组)和白藜芦醇+慢性脑低灌注组(Res组);CCH组和Res组采用2VO法建立慢性脑缺血认知功能障碍大鼠模型,Res组于建模后每天灌胃白藜芦醇50 mg/kg,分别于3、6、9周采用Bederson神经功能缺损评分及Morris水迷宫检测各组大鼠学习记忆能力,HE评估病理组织学损伤,ELISA检测脑损伤标记物和氧化应激因子变化,TUNEL检测神经细胞凋亡情况,免疫荧光检测MAP2表达,观察神经元存活。结果:缺血发生3、6、9周,CCH组大鼠Bederson评分明显升高,潜伏期延长和游泳距离增加,与Sham组相比差异显著(P<0.05),说明大鼠学习记忆能力下降,白藜芦醇干预后认知功能明显改善,大鼠额叶皮层及海马区细胞结构和神经元形态得以修复,神经元变性坏死现象得到改善,脑损伤标记物降低,氧化应激损伤受到抑制;此外,Res组大鼠MAP2表达明显升高,海马区神经元细胞凋亡降低。结论:白藜芦醇可以减轻CCH大鼠脑损伤,抑制氧化应激损伤,降低神经元细胞凋亡,改善学习记忆能力。2.白藜芦醇通过PI3K/AKT/mTOR通路抑制自噬改善慢性脑缺血认知功能障碍目的:探索白藜芦醇对CCH大鼠自噬的影响,探讨PI3K/AKT/mTOR的调控机制。方法:免疫荧光和Western blot分别检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和cleaved Caspase3;自噬相关蛋白Beclin1和LC3II/I表达以及PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白表达。在此基础上建立白藜芦醇+慢性缺血+PI3K抑制剂LY294002组(PI3K组),Morris水迷宫检测各组大鼠学习记忆能力,HE染色观察脑组织损伤,ELISA检测氧化应激损伤,Western blot检测凋亡和自噬相关蛋白。结果:Res组促凋亡因子Bax和cleaved Caspase3表达明显降低,抑凋亡因子Bcl-2表达升高(P<0.05),自噬相关蛋白检测结果显示CCH组大鼠脑组自噬因子表达显著升高,存在过度自噬现象,当给予白藜芦醇治疗后Beclin1和LC3II/I表达明显降低(Vs.CCH,P<0.05);与此同时,白藜芦醇激活PI3K/AKT/mTOR信号通路,PI3K表达明显升高,同时AKT和mTOR磷酸化水平明显增加(Vs.CCH,P<0.05);将PI3K抑制剂LY294002和白藜芦醇一起给予CCH大鼠,实验结果显示PI3K组大鼠认知和空间记忆能力较差;大鼠额叶皮层和海马区的脑组织松弛,神经元损伤最为明显;氧化应激损伤未得到缓解,细胞凋亡率升高,促凋亡因子表达升高,过度自噬现象未能受到抑制。结论:白藜芦醇可以通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制CCH大鼠自噬水平,改善CCH大鼠学习记忆能力。3.白藜芦醇激活Slit2/Robo4通路改善血管再生功能缓解慢性脑缺血性认知功能障碍目的:探索白藜芦醇对CCH大鼠血管再生功能的改善作用,探讨Slit/Robo通路的调控机制。方法:Western blot和q RT-PCR检测Slit/Robo通路相关蛋白Slit2、Robo4以及血管内皮相关因子ET-1、VEGF、SDF-1α和e NOS表达;建立白藜芦醇+慢性脑缺血+Robo阻断剂(SR组),免疫荧光检测MAP2评价血管损伤及修复情况;评估神经功能评分,水迷宫实验检测其认知功能。结果:通过q RT-PCR和Western blot法检测Slit2/Robo4通路相关蛋白Slit2/Robo4表达情况,结果显示,与Sham组相比,CCH组Slit2和Robo4表达升高,与CCH组相比,Res组Slit2和Robo4表达进一步升高(P<0.05);给予Robo阻断剂后,SR组MAP2表达降低。与CCH组相比,Res组e NOS、VEGF和SDF-1α表达升高,ET-1表达降低,组间比较具有统计学差异(P<0.05);加入Robo抑制剂后,Res对其相关因子的改变受到抑制,同时Robo抑制剂逆转白藜芦醇对神经功能评分的提升作用以及认知水平。结论:白藜芦醇可以激活Slit2/Robo4通路,改善血管内皮功能,改善CCH大鼠认知功能障碍。