研究背景:主动脉夹层,是具有高死亡率的大血管疾病,该病起病急,预后差,目前除外科手术(主动脉人工血管置换或腔内隔绝手术)外尚无其他药物治疗方式。近几年来我国患主动脉夹层的人数越来越多,发病年龄主要为40～50岁,且以男性为主。大多数主动脉瘤平常没有任何症状,且多在诊断胸腹部其他疾病时偶然被诊断出来,然而,如果损害因素持续作用,主动脉瘤将进展成为急性主动脉夹层,导致心包填塞、中风、急性主动脉返流、血胸、截瘫等危及生命的并发症。因此,主动脉瘤/夹层的高死亡率和逐年上升的发病率导致预防和预测成为这一领域非常活跃的研究,控制降低危险因素以及研究一些致病靶点基因是至关重要的。既往认为该病的危险因素有高血压、动脉粥样硬化,血管结缔组织疾病,血管炎症,血脂异常,阳性家族史,年龄,性别,吸烟,创伤等,而发病机制主要涉及基因突变、细胞外基质降解、细胞凋亡等。在风险因素中,高血压排在主动脉瘤及主动脉夹层风险因素的首位;但近年来,越来越多的临床案例报道称甲基苯丙胺(METH)与动脉夹层的形成也有关。在美国,METH的滥用已被确认为在继高血压后造成致命的急性主动脉夹层最常见的危险因素。建议所有年龄在50岁以下主动脉夹层的患者应定期接受甲基苯丙胺的尿液筛查。2010年,美国的德克萨斯大学进行了基于人群的流行病学研究来检查安非他明滥用/依赖与主动脉夹层之间的关系,此项研究表明在18-49岁的人群中,主动脉夹层的住院率增加,而50岁及以上的患者住院率没有增加。因此,在年轻成人中苯丙胺类滥用与主动脉夹层发生之间仍然存在强烈显著的关联性。但有关METH诱导动脉夹层发生的实验研究还未见报道。基于上述分析,在本课题组的前期研究中,我们利用BAPN和METH联用成功诱发主动脉瘤/夹层的发生,并观察到C/EBP β在METH诱导的动脉瘤/夹层模型中表达上调,且体外实验证实C/EBP β可以调控基质金属蛋白酶MMP2/MMP9的表达,从而影响血管中膜的结构稳定,同时C/EBPβ还可调控血管平滑肌细胞(VSMC)的凋亡,但其具体调控机制尚不清楚。在人主动脉夹层患者的组织标本中,经常观察到血管中膜基质成分的降解及VSMCs的凋亡,这些是主动脉瘤/夹层发生的主要病理改变之一。那么,METH诱导的中膜基质成分降解和平滑肌细胞凋亡是否最终导致主动脉夹层/瘤的发生,C/EBPβ在这一过程中是否发挥重要作用,它又是如何来调控这两个生物学过程呢?这是本研究要解决的核心问题。通过这一研究探讨METH诱导主动脉瘤/夹层发生的分子机制,为主动脉瘤/夹层预防和治疗策略提供重要的分子作用靶点。目的:本研究在前期体外实验已经证实C/EBP β能够调控MMP2/MMP9表达的基础上,进一步在动物整体水平上验证C/EBP β通过调控MMP2/MMP9的表达,导致中膜基质的降解,从而促发动脉瘤/夹层的发生。我们拟通过尾静脉注射合成的C/EBP β腺病毒(AD-shC/EBP β)或阴性对照(AD-shGFP),然后在此基础上联用BAPN和METH建立动物模型,运用HE以及VG(Hematoxylin-Eosin and Verhoeff-van Gieson staining)染色技术观察大鼠主动脉结构变化,并统计主动脉瘤/夹层的形成率,在动物整体水平上探讨C/EBPβ调控MMP2/MMP9表达以及调控平滑肌细胞的凋亡的机制。同时在通过体外建立METH中毒的细胞模型,使用siRNA干扰技术,然后通过蛋白质免疫印迹、免疫组织化学染色、免疫荧光染色等方法检测动物模型的主动脉组织以及细胞模型中凋亡的maker基因(cleaved Caspase-3和cleaved PARP)、C/EBPβ、IGFBP5、P53、PUMA的表达水平,探讨C/EBPβ调控METH诱导的主动脉瘤/夹层中凋亡发生的分子机制。并通过蛋白免疫印迹在人体标本上对C/EBPβ、IGFBP5、凋亡等因子进行验证。为研究主动脉瘤/夹层发生的致病靶点以及预防治疗措施提供新的理论依据。方法:第一部分:沉默C/EBP β对METH+BAPN诱导的主动脉瘤/夹层发生的影响1、腺病毒AD-shC/EBP β沉默C/EBP β后对METH诱导的动脉瘤/夹层发生的影响前期我们利用BAPN和METH联用构建了大鼠主动脉瘤/夹层动物模型,并检测到C/EBP β表达上调,为进一步研究C/EBP β在METH诱导的主动脉瘤/夹层中的作用,我们构建了沉默C/EBP β表达的腺病毒,通过尾静脉注射到大鼠体内,观察C/EBPβ沉默后,对METH诱导的主动脉瘤/夹层形成的影响。选用三周龄(约40g左右)大小的雄性SD大鼠,随机分组,设立AD-shGFP组,AD-shC/EBPP组,AD-shGFP+METH+BAPN 组,AD-shC/EBPβ+METH+BAPN组。四组大鼠均在实验的第1天、第12天、第23天、第34天上午9:00尾静脉注射1.6 x 1010 PFU 的AD-shC/EBP β或者AD-shGFP,并且AD-shGFP+METH+BAPN组和AD-shC/EBPβ+METH+BAPN组在第一天开始进行BAPN(1g/Kg/day,i.g)给药处理,持续4周;第三周开始联合METH(5mg/Kg,2次/day,i.p)给药处理,连续4周;同时AD-shGFP组和AD-shC/EBPβ组给予等量生理盐水处理。以此建立主动脉瘤/夹层的动物模型。2、通过HE和VG染色染色技术观察大鼠主动脉结构变化,并统计成瘤率上述动物在最后一次METH给药24h后,麻醉,进行左心室灌注后取主动脉组织进行拍照,主动脉弓的一部分置于多聚甲醛溶液固定后制成石蜡切片进行HE和VG染色观察大鼠主动脉结构变化,并统计成瘤率。3、通过分子生物学技术在动物水平探究沉默C/EBPβ对MMP2/MMP9表达及其调控机制的影响给药结束后,取各组动物主动脉弓部分组织提取蛋白质,通过蛋白质免疫印迹检测各组C/EBPβ、MMP2、MMP9、p-Smad3、p-ERK的表达水平并分析。第二部分:C/EBP β通过调控平滑肌细胞的凋亡介导甲基苯丙胺诱导的主动脉瘤/夹层的发生1、细胞水平探讨C/EBPβ对METH中毒的VSMCs凋亡的调控机制(1)、主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)原代培养:取100-120g左右的SD大鼠,离断脊髓处死,于超净台中快速提取血管中膜层。在培养皿中剪碎中膜,然后将组织块移入含20%FBS的DMEM培养液的培养瓶中均匀贴壁,垂直静置于含37℃和5%C02的细胞培养箱中2～3h,然后放平培养瓶使其在细胞培养箱中静置一周,一周以后开始每三天进行一次换液。待VSMCs传代至第三代后,按需将细胞接种于共聚焦皿或6孔板中,待密度达到70%～80%时开始后续实验。(2)、建立METH中毒的VSMCs模型:根据前期研究结果,采用1.0mmol/L METH感染原代培养三代以后的6孔板中的VSMCs并设置0-24h的时间梯度建立细胞中毒模型。实验结束提取细胞总蛋白,通过蛋白质免疫印迹方法检测C/EBPβ、cleaved Caβase3、cleaved PARP的表达变化情况。(3)、C/EBPβ对METH中毒的VSMCs凋亡的调控:根据前期研究结果,选用针对大鼠的,两个敲除效率良好的C/EBPβsiRNA干扰片段,将VSMCs随机分为4组:空白对照组(CtrlsiRNA)、给药组(METH+CtrlsiRNA)、给药+小干扰片段1组(METH+siC/EBPβ 1#)、给药+小干扰片段2组(METH+siC/EBPβ2#),首先使用lipo3000脂质体将小干扰片段转染入VSMCs,转染24h后,实验组中再使用1.Ommol/L METH进行感染8h,处理结束后通过Western Blot,TUNEL染色检测 C/EBPβ、cleaved Casβase3、cleaved PARP的表达变化。(4)、C/EBPβ通过IGFBP5-P53-PUMA途径介导METH诱导的VSMCs的凋亡:取METH中毒的VSMCs模型蛋白和C/EBPβ siRNA干扰片段处理后的细胞蛋白,通过Western Blot检测IGFBP5、P53、PUMA的表达水平。(5)、设计针对大鼠的IGFBP5siRNA干扰片段,将VSMCs分为四组:空白对照组(Ctrl)、给药组(METH+CtrlsiRNA)、给药+小干扰片段1组(METH+siIGFBP5 1#)、给药+小干扰片段2组(METH+siIGFBP5 2#),首先使用lipo3000脂质体将小干扰片段转染入VSMCs,转染24h后,实验组中再使用1.Ommol/L METH进行感染8h;然后通过免疫荧光染色Western Blot等方法检测IGFBP5、P53、PUMA、cleaved Caspase3、cleaved PARP的表达水平。2、动物水平验证C/EBP β调控平滑肌细胞的凋亡及其具体机制(1)、取合成的C/EBPβ腺病毒+METH+BAPN处理的动物模型的血管组织,通过蛋白质免疫印迹检测各组C/EBPβ、IGFBP5、P53、PUMA、cleaved Caβase3、cleaved PARP的表达并分析。(2)、取本课题组前期METH+BAPN诱导的主动脉瘤/夹层动物模型的血管组织通过Western Blot、免疫组织化学和TUNEL染色检测C/EBPβ、IGFBP5、P53、PUMA、cleaved Caspase3、cleaved PARP的表达并分析。第三部分:C/EBPβ参与非甲基苯丙胺诱导的人体主动脉瘤/夹层标本中的凋亡收集本校司法鉴定中心尸检工作中遇到的主动脉瘤/夹层人体标本,取新鲜组织充分去除血管外结缔组织后提取蛋白,通过Western Blot检测C/EBPβ,IGFBP5、P53、PUMA、cleaved Caspase3、cleaved PARP的表达水平。结果:第一部分:沉默C/EBP β对METH+BAPN诱导的主动脉瘤/夹层发生的影响1、成瘤率统计及HE和VG染色检测动物模型结果根据主动脉的大体观以及HE和VG的染色结果:AD-shGFP组和AD-shC/EBPβ组未见成瘤亦未见明显弹力纤维断裂及夹层形成,AD-shGFP+METH+BAPN组明显成瘤以及主动脉组织发生严重的弹力纤维紊乱和断裂的大鼠一共有4只,AD-shC/EBPβ+ METH+BAPN组仅有1只大鼠的主动脉组织发生了弹力纤维紊乱和断裂且程度较轻,未见明显成瘤。2、通过分子生物学技术在动物水平探究沉默C/EBPβ对MMP2/MMP9表达及其调控机制的影响Western blot 结果显示,与 AD-shC/EBPβ+ METH+BAPN 组相比,AD-shGFP+METH+BAPN 组C/EBPβ 的表达水平升高;AD-shGFP组的 C/EBPβ表达水平也较AD-shC/EBPβ组高但低于AD-shGFP+METH+BAPN 组。P-Smad3、p-ERK、MMP2、MMP9的表达均随C/EBPβ的沉默而降低。第二部分:C/EBP β通过调控平滑肌细胞的凋亡介导甲基苯丙胺诱导的主动脉瘤/夹层1、细胞水平上C/EBPβ对METH中毒的VSMCs凋亡的调控机制(1)、1.Ommol/LMETH按照Oh、2h、4h、8h、12h、24h时间梯度依次处理VSMCs后Western blot结果显示:C/EBPβ、cleaved Capase3、cleaved PARP的表达量均在2h开始升高,在处理8h或12h时达到峰值。(2)、使用 siRNA沉默C/EBPβ后:Western blot结果显示METH+ Ctrl siRNA组C/EBPβ的表达量明显升高,与METH中毒的VSMCs模型蛋白检测结果一致,且该组表达量较其他组的表达量有显著性差异。METH + siC/EBPβ 1#组和METH+siC/EBPβ 2#组的 C/EBPβ 表达量均降低;但 METH+siC/EBPβ 2#组C/EBPβ下降更为显著。cleaved Caspase3、cleaved PARP的表达量则均随C/EBPβ的下降而降低。选用siC/EBPβ2#转染VSMCs后的TUNEL染色结果与Western blot的结果一致。(3)、C/EBPβ通过IGFBP5-P53-PUMA途径介导METH诱导的VSMCs凋亡:METH中毒的VSMCs模型蛋白Western Blot结果显示:IGFBP5、P53、PUMA的表达水平在METH中毒的VSMCs模型蛋白上的变化趋势类似于C/EBPβ,表达量均在处理2h开始升高,在处理8h或12h时达到峰值。而C/EBPβ siRNA干扰片段处理后的细胞蛋白检测结果显示:IGFBP5、P53、PUMA的表达水平则随C/EBPβ的沉默而降低。(4)、使用siRNA沉默IGFBP5后,Western blot结果显示METH+ Ctrl siRNA组IGFBP5的表达量明显升高,与METH中毒的VSMCs模型蛋白检测结果一致,且该组表达量较其他组的表达量有显著性差异。METH+ siIGFBP5 1#组和METH+siIGFBP5 2#组的 IGFBP5 表达量均降低;但 METH+siIGFBP5 1#组IGFBP5下降较为显著。同时,P53、PUMA、cleaved Caspase3、cleaved PARP的表达量均随IGFBP5的沉默而降低。选用siIGFBP5 1#转染VSMCs的免疫荧光染色结果与上述结果一致。2、动物水平验证C/EBP β调控平滑肌细胞的凋亡及其具体机制(1)、合成的C/EBP β腺病毒+METH+BAPN处理的动物模型的血管组织,通过蛋白质免疫印迹检测结果显示:IGFBP5、P53、PUMA、cleaved Capase3、cleaved PARP的表达水平与C/EBP β的表达均在AD-shGFP+METH+BAPN组最高,并且其他因子随着C/EBP β的沉默而表达降低。(2)、METH+BAPN诱导的主动脉瘤/夹层动物模型的主动脉组织Western Blot结果显示:BAPN+METH处理组的C/EBPβ、IGFBP5、P53、PUMA、凋亡因子(cleaved Caspase3和cleaved PARP)的表达量比BAPN组、METH组、对照组明显升高。C/EBPβ、IGFBP5的免疫组织化学结果以及凋亡因子的TUNEL染色结果均与蛋白质免疫印迹结果一致。第三部分:C/EBPβ参与非甲基苯丙胺诱导的人体主动脉瘤/夹层标本中的凋亡人体标本结果显示,C/EBPβ、IGFBP5、P53、PUMA、cleaved Caspase3、cleaved PARP的表达量在人体主动脉瘤及主动脉夹层标本中均高于正常对照组。结论:1、C/EBPβ通过调控MMP2/MMP9的表达,导致中膜基质的降解,从而促发动脉瘤/夹层的发生,沉默C/EBPβ将减少METH诱导的主动脉瘤/夹层的发生。2、C/EBPβ通过IGFBP5-P53-PUMA途径调控平滑肌细胞的凋亡介导甲基苯丙胺诱导的主动脉瘤/夹层的发生。3、C/EBP(β-IGFBP5-P53-PUMA途径也参与了非METH所致的人体主动脉瘤及主动脉夹层中的凋亡。