论文部分内容阅读
目的:1.探讨肝X受体(Liver X receptors,LXRs)激动剂TO901317促进GF诱导人骨髓间充质干细胞(human bone marrow derived mesenchymal stem cells,hBMSCs)向多巴胺能神经元(Dopaminergic neurons,DA)分化的方案。2.观察TO901317联合GF诱导hBMSCs分化的多巴胺能神经元体外功能。3.初步探讨TO901317促进GF诱导hBMSCs向多巴胺能神经元分化的机制。4.观察TO901317联合GF诱导分化的多巴胺能神经元对6-OHDA致SD大鼠帕金森病的治疗作用。方法:1.确定TO901317促进GF诱导hBMSCs向多巴胺能神经元分化的浓度、加入时间和诱导分化时程。(1)确定TO901317促进GF诱导hBMSCs向多巴胺能神经元分化的浓度。根据加入TO901317的浓度(0.125、0.25、0.5、1、2mM),将h MBSCs分为五个组。各组均联合生长因子(growth factors,GF)诱导hBMSCs分化为多巴胺能神经元。联合诱导培养hBMSCs分化12天后,采用免疫荧光检测Tuj1和酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)表达。计算TH阳性细胞率。(2)确定TO901317促进GF诱导hBMSCs分化的加入时间。在确定TO901317联合GF诱导hBMSCs分化的浓度后,在GF处理hBMSCs的基础上,分别在GF处理细胞的第1天、第3天、第6天和第9天加入已确定的TO901317诱导浓度联合培养。细胞培养12天后,免疫荧光检测Tuj1和TH。计算TH阳性细胞率并确认TO901317促进GF诱导hBMSCs分化的加入时间。(3)确定TO901317联合GF诱导hBMSCs向多巴胺能神经元分化的时程。在确定了TO901317联合GF诱导分化浓度和加入时间后,使用TO901317联合GF处理hBMSCs时程分别为3天、6天、9天和12天,免疫荧光检测Tuj1和TH。计算TH阳性细胞率并确定TO901317联合GF诱导hBMSCs分化时程。最终确定TO901317联合GF诱导hBMSCs分化的方案。2.TO901317联合GF诱导hBMSCs分化的细胞体外功能检测。在确定了TO901317联合GF诱导hBMSCs分化的方案之后,将细胞分为对照组(Control)、细胞因子组(GF)和LXR+GF组,免疫荧光和蛋白免疫印迹测定诱导分化的细胞TH表达;ELISA试剂盒检测多巴胺的释放;免疫荧光检测Neun和Nestin表达。3.初步探讨TO901317促进GF诱导hBMSCs分化为多巴胺能神经元的机制。免疫荧光检测各组LXRa、LXRb表达;实时荧光定量PCR(Realtime quantitative polymerase chain reaction,q PCR)检测ABCA1m RNA的表达。4.TO901317联合GF诱导hBMSCs分化的细胞对6-OHDA致SD大鼠帕金森病的作用观察。侧脑室注射6-羟基多巴胺(6-OHDA)建立Sprague-Dawley(SD)大鼠帕金森病(Parkinson’s Disease,PD)模型,将SD大鼠分为对照组(Control group)、模型组(6-OHDA group)和模型+细胞移植治疗(6-OHDA+Cells group)组。免疫荧光和Western blot检测TH表达,HE检测细胞形态病理学变化,以及阿扑吗啡诱导的行为学检测。结果:实验结果显示,LXR激动剂TO901317联合GF诱导hBMSCs分化为多巴胺能神经元的方案为:0.5μM TO901317同时加入GF诱导hBMSCs分化6天时,其分化率可以达到90%。体外实验发现TO901317联合GF诱导hBMSCs分化后的细胞具备明显表达TH以及释放多巴胺的能力。在联合GF诱导hBMSCs分化的基础上,TO901317的长期使用,LXR+GF组细胞LXRα和LXRβ水平明显下降,ABCA1m RNA表达显著升高。将诱导分化后的细胞移植到PD模型大鼠中脑黑质中,相比于模型组,细胞治疗组纹状体的TH表达显著增加,阿扑吗啡导致PD大鼠的不平衡旋转明显改善。结论:1.LXR激动剂TO901317不会影响hBMSCs的增殖,但会影响其诱导分化。2.TO901317促进GF诱导hBMSCs向多巴胺能神经元分化的方案是:0.5μM TO901317同时加入GF诱导hBMSCs分化6天,其诱导分化率可达90%。3.TO901317联合GF诱导的多巴胺能神经元具有相应的神经元功能,即具有释放多巴胺的能力。4.TO901317促进GF诱导hBMSCs向多巴胺能神经元分化的机制可能和LXR-ABCA1信号通路的激活有关。5.TO901317联合GF诱导hBMSCs分化的细胞具备多巴胺能神经元的功能,有治疗PD的潜力。