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研究背景:长链非编码RNA(Long noncoding RNA,Lnc RNA)Tre RNA1具有类增强子功能,在多种肿瘤的发生发展过程中发挥着重要作用。我们前期研究发现Tre RNA1在消化道肿瘤中表达量明显高于正常组织,而且主要定位于细胞质中。在肝细胞肝癌Hep G2细胞系中过表达Tre RNA1后,肝癌细胞的迁移能力、增殖能力和小管形成能力明显增高,细胞的凋亡能力明显降低。基因表达谱芯片结果展示过表达Tre RNA1导致了肝细胞肝癌Hep G2细胞中多种基因表达水平的改变。Tre RNA1的具体作用机制还有待进一步探明。研究方法:我们对课题组前期获得的过表达Tre RNA1 Hep G2稳定株(Hep G2-Tre RNA1)细胞及其对照组细胞进行了细胞培养稳定同位素标记技术(Stable Isotope Labeling By Amino Acids In Cell Culture,SILAC)检测,分析了其差异表达蛋白,在基因芯片差异表达大于2倍以及SILAC差异表达大于1.2倍的基因中筛选Tre RNA1的下游靶基因。通过Real-Time PCR和蛋白电泳从RNA水平和蛋白水平上验证筛选到的感兴趣基因并最终锁定PDS5B和KIF2C作为后续研究的目标分子。随后我们构建了PDS5B和KIF2C的过表达质粒和对照质粒,并瞬时转染细胞验证其过表达是否可以逆转Tre RNA1引起的功能改变。利用划痕实验验证PDS5B和KIF2C对肝癌细胞迁移能力的影响,利用CCK8实验验证PDS5B和KIF2C对肝癌细胞增殖能力的影响,通过小管形成实验验证PDS5B和KIF2C对肝癌细胞拟血管形成能力的影响。为了研究PDS5B和KIF2C在体内对Tre RNA1引起的肝癌细胞增殖能力的影响,我们包装了过表达PDS5B或KIF2C的慢病毒,并进行了细胞转染。通过嘌呤霉素和G418对细胞进行筛选,获得稳定过表达PDS5B或KIF2C的稳定株。在裸鼠皮下注射各组肿瘤细胞,构建了体内肝癌细胞增殖模型,通过对肿瘤形成率和肿瘤重量统计,验证PDS5B和KIF2C在体内对肝癌细胞增殖的影响。研究结果:SILAC结果展示过表达Tre RNA1导致了Hep G2细胞中多种蛋白的异常表达。我们共筛选出了251个差异表达蛋白,其中上调50个,下调201个。经过基因表达谱芯片和SILAC结果的联合分析筛选及表达验证,我们确定了PDS5B和KIF2C作为Tre RNA1的下游靶基因。表达验证结果显示过表达Tre RNA1组的PDS5B m RNA水平明显低于对照组而KIF2C m RNA的表达水平无明显差异,而过表达Tre RNA1组的PDS5B、KIF2C蛋白水平明显低于对照组,很好的验证了芯片及SILAC结果。Hep G2-Tre RNA1细胞中转染PDS5B或者KIF2C过表达质粒和对照组质粒,进行PCR验证显示过表达PDS5B或者KIF2C组的m RNA表达水平均明显高于对照组,蛋白电泳的结果展示过表达PDS5B或者KIF2C组的蛋白的表达水平明显高于对照组。划痕实验展示过表达PDS5B组的24及48小时细胞迁移面积分别明显低于其对照组,过表达KIF2C组的24及48小时细胞迁移面积均明显低于其对照组。CCK8实验展示过表达PDS5B或者KIF2C组的细胞活力明显低于对照组。小管形成实验展示过表达PDS5B或者KIF2C组的细胞拟血管形成能力明显低于其对照组。通过慢病毒转染我们构建了过表达Tre RNA1同时过表达PDS5B或KIF2C稳定Hep G2细胞株,并经PCR和蛋白电泳验证了其过表达。进行裸鼠体内皮下成瘤实验发现过表达PDS5B或者KIF2C的Hep G2细胞成瘤重量明显低于其对照组。结论:1.通过对基因表达谱芯片和SILAC结果的分析研究发现Tre RNA1在肝细胞肝癌中的过表达导致了一系列基因的表达异常,这些差异表达的基因可能在Tre RNA1调控肝细胞肝癌发生和发展中发挥着重要作用。2.PDS5B和KIF2C可能是TreRNA1在HepG2细胞增殖、转移过程中发挥作用的重要下游靶蛋白。PDS5B和KIF2C分别可以在细胞水平逆转Tre RNA1促进的肝癌细胞迁移、增殖及拟血管形成,并且在裸鼠体内逆转Tre RNA1过表达引起的过度增殖。