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哈蟆油(Ranae Oviductus)是我国一味传统的珍贵中药材,然而学术界对其基源考证一直存在争议。同时,市售哈蟆油也普遍存在混伪品众多、药材掺杂掺假等乱象。为解决上述难题,本研究基于哈蟆油近源物种的线粒体全基因序列中线粒体呼吸链特异基因间隔序列建立哈蟆油的特异性PCR鉴定方法,并采用该方法对采自长白山地区的19个哈蟆油样本进行基源分析。此外,利用实时荧光定量PCR技术建立哈蟆油的定量分析方法。具体实施步骤如下:1基源动物线粒体全基因序列的分析从GenBank数据库中分别下载中国林蛙(Rana chensinensis David,1875)、东北林蛙(Rana dybowskii Günther,1876)、桓仁林蛙(Rana huanrensis Liu,Zhang et Liu,1993)、黑龙江林蛙(Rana amurensis Boulenger,1886)、牛蛙(Rana catesbeiana Shaw,1802)、青蛙(Pelophylax nigromaculatus Hallowell,1860)以及中华大蟾蜍(Bufo gargarizans Cantor,1842)的线粒体全基因序列。利用MEGA v7.0软件构建线粒体全基因序列的NJ系统进化树,确定R.chensinensis、R.dybowskii和R.-huanrensis为近源物种。通过MEGA v7.0软件的Clustal W功能进行近源物种的COI、Cyt b、12S rRNA以及线粒体全基因序列的多序列比对,发现线粒体呼吸链特异基因ND5和ND6的基因间隔序列的变异性明显大于COI基因、Cyt b基因和12S rRNA基因。因此,ND5与ND6的间隔序列适合用来进行近源林蛙属的物种鉴定。2哈蟆油特异性PCR鉴定方法的建立基于R.chensinensis、R.dybowskii和R.huanrensis的线粒体呼吸链特异基因ND5和ND6的基因间隔序列分别设计上游引物LFP(Large Forward Primer)和下游引物LRP(Large Reserve Primer)。使用常规改良SDS法分别提取哈蟆油对照药材、中国林蛙油、东北林蛙油、桓仁林蛙油、黑龙江林蛙油、青蛙油和中华大蟾蜍油的基因组DNA。利用上述引物对LFP/LRP分别对各基因组DNA进行特异性PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳。中国林蛙油的扩增片段大小为856bp,东北林蛙油为692bp,桓仁林蛙油为1047bp,青蛙油为596bp。并以上述特异性PCR鉴定方法对长白山地区的19个哈蟆油样本进行鉴定,结果表明19个样本均来自于R.dybowskii。为了进一步验证鉴定结果的可靠性,基于R.dybowskii的线粒体呼吸链特异基因ND5和ND6的基因间隔序列设计了R.dybowskii的特异性引物对SFP/SRP(Small Forward Primer/Small Reserve Primer),其扩增片段大小为290bp。利用引物对SFP/SRP分别扩增长白山地区的19个哈蟆油样本,进一步证实了其均来自于R.dybowskii。3哈蟆油定量分析方法的建立基于上述哈蟆油(东北林蛙油)的线粒体呼吸链特异基因ND5和ND6基因间隔序列,使用软件Primer Express 3.0.1设计哈蟆油的特异性引物对QFP/QRP(Quantitative Forward Primer/Quantitative Reserve Primer)。按不同比例混合哈蟆油和环糊精以制备一系列(0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%)对照品。以改良SDS法分别提取其基因组DNA后进行实时荧光定量PCR反应,以哈蟆油含量及其Ct值制作标准曲线。标准曲线为y=-11.649x+30.967,R~2=0.9809,说明哈蟆油含量在0%~100%范围内线性关系良好。本研究的创新性在于:1.首次建立基于线粒体基因间隔序列特异性PCR技术的哈蟆油鉴别方法。2.首次研究采用实时荧光定量PCR法进行哈蟆油定量分析。本研究建立的鉴定方法可准确区分R.chensinensis和R.dybowskii等近源物种,无需通过基因测序,降低了检测成本,具有推广应用价值。本研究建立的哈蟆油定量分析方法,可用于哈蟆油及其相关产品中哈蟆油含量的测定,弥补现有含量测定方法的不足。