禽流感是由正粘病毒科流感病毒属A型流感病毒所引起的的禽类的感染和／或疾病综合征，其中高致病性禽流感被世界动物组织定为A类传染病。禽流感病毒的常规检测方法涉及到针对病毒抗原及病毒特异性抗体两类。常规的抗体检测方法是琼脂扩散，酶联免疫吸附试验及血凝抑制实验。蛋白质芯片技术(Protein chip)亦被称为蛋白微阵列(Protein Microarray)是一种快捷、高效、并行、高通量的蛋白质检测技术，可以应用于并行地检测数百个疾病相关分子。该技术平台的构建涉及到合适载体的选择、样品的制备及点样固定、抗体的杂交及非特异吸附物质的洗涤等。将蛋白芯片技术应用到动物病毒性疾病的检测是芯片技术的重要内容之一。本研究旨在构建并优化一种基于重组蛋白抗原芯片的可以灵敏地检测鸡血清中流感病毒特异抗体的检测技术。通过原核表达系统pET30表达禽流感病毒的表面抗原——血凝素蛋白，将纯化后的重组血凝素蛋白作为芯片的捕获抗原点样固定到芯片载体上，以类似直接ELISA的模式检测血清中的禽流感病毒抗体。研究内容主要包括：1．蛋白抗原的制备：应用RT-PCR方法扩增得到了三株禽流感病毒的全长血凝素基因，酶切PCR产物，T4连接酶连接到pET30载体中，经PCR、酶切及测序验证为正确后，、转化BL21(DE3)大肠杆菌中，添加IPTG进行诱导。在诱导结束后将表达菌通过超声波裂解及尿素的洗涤进行初步纯化，且通过NI-NTA偶联的亲和层析柱亲和层析进一步纯化。最后，重组蛋白通过透析进一步纯化并复性，免疫印迹表明三个重组蛋白均具有良好的抗原性。2．芯片的制作及条件优化：将纯化的蛋白抗原用点样仪点击到氨基或环氧基修饰的玻璃载片表面，并选择了多种点样缓冲液并测试了不同的温度、湿度下点样的效果：比较了以脱脂乳、牛血清白蛋白及胎牛血清三种不同的封闭剂进行封闭的条件下样点的信噪比、荧光密度平均值高低并确定了芯片的最佳的封闭条件；并利用方阵试验的方式确定了最佳的一抗及二抗的稀释度。最后，用构建的芯片检测梯度稀释的血清，确定了芯片的检测限及线性范围。总言之，本研究确定了三种亚型禽流感病毒血凝素基因的不同的诱导表达条件，获得了该基因在大肠杆菌系统中的超量表达，且优化了重组血凝素蛋白的纯化步骤及复性条件；同时，还初步建立了利用重组蛋白抗原检测血清抗体的基于芯片的检测方法，构建的蛋白质芯片样点形态规则，且具有良好的再现性和较小的变异度，其线形检测区间同比间接ELISA方法宽，灵敏度是相同捕获抗原建立的间接ELISA的2.5倍。本研究为下一步高密度芯片的制备奠定了基础。