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宫颈癌是严重危害女性健康的疾病之一,而人乳头瘤病毒(HPV)的感染是导致宫颈癌的主要因素。虽然目前已经有三种预防性HPV疫苗批准上市,能够保护约90%的HPV感染引起的宫颈癌,但其对已经建立的HPV持续感染、癌前病变及癌症并没有治疗效果。因此,研发有效的治疗性HPV疫苗对于临床治疗HPV相关肿瘤具有重要意义。转化生长因子-β1(TGF-β1)是肿瘤微环境中关键的免疫抑制分子,其能够诱导初始T细胞分化为调节性T细胞(Treg),分化的Treg细胞通过多种机制显著抑制效应T细胞分化、增殖及功能。TGF-β1促进骨髓来源免疫抑制细胞(MDSCs)分化、增殖及向肿瘤迁移。此外,TGF-β 1也可促肿瘤细胞增殖、促肿瘤血管生成、刺激细胞外基质表达等促进肿瘤的生长与转移。除了 Treg细胞,肿瘤微环境中的免疫抑制细胞MDSCs、肿瘤相关巨噬细胞、以及成纤维细胞等都能够表达TGF-β1。因此,靶向TGF-β 1进行干预,具有拮抗肿瘤免疫抑制微环境,促进抗肿瘤免疫的潜力。Toll-样受体(TLR)3/9以及STING激动剂cGAMP显示了强效的诱导Thl/CTLs偏向的细胞免疫应答的能力,是有潜力的肿瘸疫苗佐剂;而纳米材料有助于抗原被DCs高效摄取、加工以及抗原向淋巴结迁移提高DCs激活效率,此外,纳米材料可提高抗原与核酸免疫刺激物的体内稳定性并促进两者向DCs的同时递送,利于高效激活免疫应答。因此,核酸佐剂与纳米材料的联合应用,具有诱导强的肿瘤抗原特异细胞免疫的潜力。目前肿瘤疫苗面临巨大挑战其中重要的原因是肿瘤抑制微环境对Thl/CTLs的抑制以及疫苗未诱导强的Thl/CTLs应答,因此本研究拟通过抗细胞因子主动免疫靶向调控TGF-β 1以拮抗肿瘤免疫抑制微环境,以及应用新型核酸与纳米材料佐剂以刺激抗肿瘤免疫这两个方面,探讨提高治疗性疫苗抗肿瘤作用的有效策略。在靶向TGF-β 1的研究中,基因重组获得的呈现了 TGF-β 1抗原肽的乙肝核心抗原(HBcAg)病毒样颗粒(VLPs)经预防性策略免疫小鼠,激发TGF-β 1特异的抗体应答,然后皮下接种TC-1肿瘤细胞,当肿瘤长至5-6 mm大小时,以治疗性策略进行携带了 HPV16 E7肽的HBcAg VLPs治疗性HPV疫苗的免疫干预。肿瘤大小监测显示,抗TGF-β 1主动免疫显著增强了治疗性HPV疫苗接种对肿瘤生长的抑制;ELISA表明IgG1/IgG2a的比例显著降低,IFN-y水平升高而IL-4降低,提示Thl应答获得增强;ELISPOT结果表明,分泌IFN-γ的淋巴细胞水平显著提高,相应地,流式分析显示小鼠CD4+IFN-γ+与CD8+IFN-γ+效应细胞数目显著增加,而CD4+Foxp3+Treg细胞数目显著降低;同时,肿瘤组织血管生成及VEGF基因水平表达受到显著抑制;此外,Real time PCR检测表明IFN-γ、TNF-α及效应T细胞趋化因子CCL19基因表达水平上调,而MDSCs细胞趋化因子CXCL1基因水平下调;进一步的检测证实,TGF-β 1信号通路激活关键分子pSmad3的水平降低。在核酸与纳米材料佐剂研究中,阳离子脂质体DOTAP联合核酸佐剂CpG、Poly I:C和cGAMP显著促进了治疗性VLPs疫苗激发的肿瘤生长抑制作用,提高了分泌IFN-γ 的淋巴细胞、CD8+IFN-γ+、CD8+CD107a+、CD4+IFN-y+效应 T 细胞、以及CD8+CD44+、CD4+CD44+免疫记忆T细胞水平,降低了免疫抑制的CD4Foxp3+Treg细胞与CDllb+Gr-1+MDSCs水平。进一步以PLGA/DC-chol/HA新型纳米颗粒作为E7肽表位及核酸刺激物的递送载体,获得了类似的结果。体外实验显示,纳米颗粒与核酸佐剂尤其核酸佐剂联合应用有效增强了 BMDC表面成熟标记CD40、CD80、CD83、CD86、MHC-I分子的表达,同时,促进细胞因子TNF-a、IL-2和IL-12的分泌;在小鼠体内实验中,以预防性策略和治疗性策略免疫接种,纳米颗粒联合核酸佐剂尤其核酸佐剂组合显著抑制了小鼠肿瘤的生长,具有增强的CD8+IFN-γ+、CD8+CD107a+、CD4+IFN-γ +、CD8+CD44+、CD4+CD44+T 细胞水平,以及降低的 CDllb+Gr-1+MDSCs细胞水平,提示有效激发了 CTLs/Th1偏向的抗肿瘤免疫应答。本研究结果强烈提示,抗细胞因子主动免疫靶向调控TGF-β1以及纳米材料联合核酸佐剂尤其是佐剂组合,显著增强了治疗性HPV疫苗激发的抗肿瘤效力与免疫应答,是有潜力的联合免疫策略,为治疗性肿瘤疫苗的研发提供了新的思路。