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目的本研究在收集非癌子宫内膜及子宫内膜癌组织的基础上,明确miR-152与受试个体IL-6及体质指数、血糖、血脂等一般资料的相关性;运用生物信息学方法预测受miR-152调控的下游靶基因,并在子宫内膜组织中进行验证;在体外培养子宫内膜癌细胞Ishikawa的基础上,明确IL-6是否通过抑制miR-152的表达,促进子宫内膜癌细胞的生物学行为,并进一步验证miR-152对其下游靶基因表达调控作用。通过以上研究,尝试阐明肥胖相关子宫内膜癌发生发展的分子机制,为子宫内膜癌早期诊断和临床治疗药物靶点的筛选提供实验数据和理论基础。方法(1)子宫内膜组织的收集及分组:2017年9月-2018年12月,在石河子大学医学院第一附属医院妇产科门诊及病房,收集60例非癌受试者(NC组)和30例子宫内膜癌患者(EC组)的一般资料、血液样本及子宫内膜组织标本;(2)全自动生化分析仪检测血脂、血糖、游离脂肪酸等生化指标。运用qRT-PCR及酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测血清中miR-152及IL-6的含量,运用qRT-PCR及Western Blot技术检测子宫内膜组织中miR-152及IL-6的表达水平,并进一步分析miR-152与受试个体IL-6及一般资料的相关性;(3)运用miRNA靶基因预测软件(Targetscan、miRDB、microT-CDS)预测miR-152下游与增殖迁移相关的靶基因;(4)体外培养人源子宫内膜癌Ishikawa细胞,将IL-6重组蛋白作用于细胞,运用细胞转染技术,分别上/下调miR-152,qRT-PCR、Western-blot实验技术检测miR-152及下游关键基因的mRNA及蛋白表达水平;(5)运用双荧光素酶报告基因实验,在Ishikawa细胞中检测miR-152对下游靶基因的调控关系;(6)运用CCK-8、Transwell及划痕实验,检测IL-6及miR-152对Ishikawa细胞增殖、侵袭以及迁移能力的影响;(7)应用SPSS 20.0软件对数据分析,数据正态分布使用t检验、数据非正态分布使用秩和检验,多组间相互比较采用单因素方差分析,以P<0.05为差异有统计学意义。结果1、人体组织实验(1)非癌与子宫内膜癌受试个体体质指数、血脂及游离脂肪酸含量的比较子宫内膜癌患者体重,体质指数(Body Mass Index,BMI),腰围(waist circumference,WC),总胆固醇(Total Cholesterol,TC),甘油三酯(Triglyceride,TG),低密度脂蛋白(Low Density Lipoprotein,LDL)显著高于非癌个体(P<0.05),高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)显著低于非癌个体(P<0.05)。子宫内膜癌患者血清中游离脂肪酸(Free Fatty Acids,FFA)含量显著高于非癌个体(P<0.01)。(2)非癌与子宫内膜癌受试个体血清及子宫内膜组织中miR-152与IL-6的表达水平比较子宫内膜癌受试个体血清及子宫内膜组织中,IL-6的表达水平均高于非癌个体(P>0.05);miR-152在子宫内膜癌受试个体血清及癌组织中的表达均显著低于非癌个体,差异具有统计学意义(P<0.05)。(3)miR-152与IL-6及受试个体一般资料的相关性分析在子宫内膜癌受试个体中,miR-152与IL-6、体重、BMI负相关,与腰围、TC、TG、LDL、Glu显著负相关(P<0.05),与HDL正相关。(4)生物信息学预测miR-152下游靶基因运用miRNA靶基因预测软件Targetscan、miRDB、microT-CDS预测miR-152下游与增殖迁移相关的靶基因,结果发现DDX6及CBLB的3’UTR与miR-152有结合位点,可能是miR-152的下游靶基因。(5)非癌与子宫内膜癌中DDX6及CBLB的表达水平与非癌个体子宫内膜组织相比,子宫内膜癌患者组织中DDX6及CBLB的mRNA及蛋白表达水平显著升高。2、体外细胞实验(1)外源性IL-6作用浓度及时间的筛选用25、50以及100 ng/ml的IL-6重组蛋白分别刺激Ishikawa细胞24、48、72h后,检测对细胞增殖能力的影响。结果显示,50ng/ml的IL-6重组蛋白处理细胞24h和48h后,对细胞增殖的促进能力最为显著(P<0.05),可用作后续实验。(2)外源性IL-6显著抑制miR-152的表达,并促进子宫内膜癌细胞的生物学行为50ng/ml的IL-6重组蛋白作用于Ishikawa细胞24h后,miR-152的表达水平显著降低(P<0.05);同时,显著促进了Ishikawa细胞的增殖及迁移能力(P<0.05)。(3)miR-152负向调控DDX6及CBLB的表达,并抑制子宫内膜癌细胞的生物学行为在Ishikawa细胞中转染miR-152 mimic 24h后,DDX6及CBLB的mRNA及蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。同时,显著抑制了Ishikawa细胞的增殖及迁移能力(P<0.05);在Ishikawa细胞中转染miR-152 inhibitor 24h后,DDX6及CBLB的mRNA及蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。在293T细胞中分别转染miR-152 mimic和miR-152 inhibitor 24h后,DDX6及CBLB的mRNA表达水平相应的出现降低和升高,且差异均具有统计学意义(P<0.05)。(4)miR-152可能靶向抑制DDX6及CBLB的表达在Ishikawa细胞中,转染miR-152 mimic,并转染DDX6及CBLB野生型及突变型质粒,双荧光素酶报告基因实验结果显示:在分别转染野生型DDX6及CBLB质粒的同时转染miR-152 mimic后,与野生型NC组相比,DDX6及CBLB野生型质粒荧光素酶活性值显著降低(P<0.05)。(5)IL-6通过抑制miR-152促进下游基因DDX6、CBLB的表达,并促进子宫内膜癌细胞的生物学行为在IL-6刺激Ishikawa细胞的同时,转染miR-152 mimic上调miR-152的表达,与单纯IL-6刺激组相比,在IL-6刺激细胞的同时上调miR-152后,DDX6及CBLB的表达被抑制(P<0.05),并且Ishikawa细胞的增殖及迁移能力被显著抑制(P<0.05)。结论1.IL-6高表达及miR-152低表达,可能是肥胖相关子宫内膜癌发生的危险因素。2.IL-6可能通过抑制miR-152导致其下游靶基因DDX6、CBLB表达上调,最终促进了子宫内膜癌的发生和发展。