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肿瘤是与多基因、多因素相关的疾病,大多数肿瘤的发生与原癌基因的突变、过度表达以及抑癌基因的突变、失活相关。抑制肿瘤相关基因的表达一直是研究新型抗肿瘤方法的重要思路。RNA干扰（RNA interference,RNAi）现象发现于1995年,是在转录后水平沉默相应基因表达的基因阻断新技术,是近几年基因治疗的热点。RNAi技术的原理是小干扰RNA（siRNA）利用碱基互补的原理,引导RNA诱导的沉默复合物（RISC）特异性识别并结合目的基因的mRNA,引发mRNA降解,抑制肿瘤相关蛋白质的生成,诱使肿瘤细胞凋亡或使其向成熟方向分化,从而抑制肿瘤增殖。垂体瘤转化基因（PTTG）在正常细胞的增殖、分化及凋亡过程中起重要作用。研究表明,PTTG1基因的高表达与多种肿瘤的发生发展密切相关。利用RNAi技术沉默人喉癌Hep-2细胞中PTTG1基因的表达,阻止或延缓肿瘤细胞的生长具有现实意义和潜在的临床应用价值。本研究根据GenBank中登录的人PTTG1基因mRNA序列（NM004219.2）,利用美国Applied Biosystems公司提供的siRNA在线设计软件筛选了针对mRNA序列上2个不同靶位点的2对互补DNA单链,分别稀释为相同浓度后将互补单链分别等量混匀,退火为双链DNA分子,分别命名为PTTG1a和PTTG1b。两双链DNA分子5’端和3’端分别带有EcoRⅠ、BamHⅠ黏性末端。真核表达质粒载体plk0.1-puro经EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切后,回收6312bp的大片段,与PTTG1a和PTTG1b分别连接,构建了表达短发夹RNA（shRNA）的2种重组质粒。经双酶切鉴定和测序鉴定,2种重组质粒构建成功,分别命名为plk0.1-puro/PTTG1a和plk0.1-puro/PTTG1b。提质粒并经分光光度计测定,表明两种重组质粒溶液的纯度均较高,可应用于转染实验。同时,将嘌呤霉素稀释为8种不同浓度,加入到培养的人喉癌Hep-2细胞系,持续培养14d,观察嘌呤霉素对细胞存活的影响。重组质粒plk0.1-puro/PTTG1a和plk0.1-puro/PTTG1b均稀释为不同浓度,在脂质体LipofectamineTM2000介导下转染Hep-2细胞系,用嘌呤霉素筛选,于转染12d后收集细胞,分别提取总RNA、蛋白质,以β-actin为内参,采用RT-PCR和Western blot技术分别检测PTTG1基因的mRNA、蛋白质的相对表达水平。结果显示,与空白对照组相比,随质粒浓度的增加,PTTG1基因mRNA、蛋白质的相对表达水平均逐渐降低;6孔板中每孔转染1000ng、1200ng质粒时,plk0.1-puro/PTTG1a对PTTG1基因的抑制率可达70%以上,plk0.1-puro/PTTG1b的抑制率则低于20%。故后续实验以plk0.1-puro/PTTG1a进行操作。同一浓度（1000ng/孔）的重组质粒plk0.1-puro/PTTG1a在脂质体介导下转染培养于6孔板的Hep-2细胞系,经嘌呤霉素筛选后,分别在转染后7d、12d、18d收集细胞,提取总RNA、蛋白质,以β-actin为内参,分别以RT-PCR、Western blot技术检测PTTG1基因mRNA、蛋白质相对表达水平。结果显示,与空白对照组相比,随时间的延长,PTTG1基因mRNA、蛋白质的相对表达水平均逐渐降低;转染超过12d时,PTTG1基因mRNA、蛋白质的相对表达水平下降70%以上。一般,对目的基因的抑制效率达到70%以上的siRNA序列具有较好的应用前景。本实验构建的重组质粒plk0.1-puro/PTTG1a,在六孔细胞培养板中以1000ng/孔转染12d以上时,人喉癌Hep-2细胞内PTTG1 mRNA和蛋白质相对表达水平降低了70%以上,有效抑制了PTTG1基因的表达,故重组质粒plk0.1-puro/PTTG1a在关于PTTG1基因的研究中具有较好的应用价值。