脂肪酶(Lipase，EC3.1.1.3)因其广泛的工业应用价值而倍受人们关注，它广泛存在于动物组织、植物种子和微生物体中。本实验室已经将脂肪酶成功应用于乳酸乙基糖苷酯(EthylglucosideLactate)、乳酸乙基单油酸脂(EthylglucosideMonooleate)的合成，手性苯基乙醇(phenylethanol)、手性叔丁基亮氨酸(tert-leucine)、手性柿洛芬葡聚糖衍生物(buprofenglucopyransidederivative)的拆分以及脂肪酶催化转脂反应生产生物柴油等研究。为从源头解决生物催化中酶的来源问题，获得更多更优的脂肪酶生物催化剂，本课题从不同样品中克隆得到脂肪酶基因，并在部分基因实现异源系统中表达的基础上，利用酵母表面展示技术进行脂肪酶的酵母表面展示，为降低脂肪酶生物催化中酶纯化和固定化的成本，开发新型的全细胞生物催化剂作了有益的尝试。另外，本实验还利用酵母同源重组的特性，结合酵母表面展示技术进行获得杂合脂肪酶基因的初步研究，为脂肪酶的定向进化奠定基础。 本实验分别对荧光假单孢菌、环境样本、解脂耶氏酵母和蓖麻种子中的脂肪酶基因进行了克隆，得到7个脂肪酶基因，其中4个全新序列的脂肪酶基因已分别提交GenBank，这些脂肪酶基因分别是lipJ02(AY673674)、lipJ03(AY700013)、lipB52(AY623009)和LipRC1(DQ435596)，为下一步的工作积累了丰富的脂肪酶基因资源。 通过分析荧光假单孢菌脂肪酶的氨基酸序列，发现有两段保守的氨基酸残基(PWNPDSE和TWVQDLNR)序列，根据这两个氨基酸残基序列设计并合成简并引物。 分别用正、反向引物，以本实验室筛选得到的产脂肪酶菌株P.fluorescensB52基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到～800bp脂肪酶基因的部分序列。根据此序列设计基因特异性引物，通过Genome-Walking的方法分别得到其上、下游序列。序列分析得到包含1854bp开放阅读框(ORF)的脂肪酶基因lipB52，该基因编码617个氨基酸。 提取环境样本DNA，利用上述类似的方法从环境样本中直接克隆得到脂肪酶基因lipJ02、lipJ03，其中lipJ02包含1425bp的开放阅读框，编码474个氨基酸，lipJ03包含1413bp的开放阅读框，编码470氨基酸。与通过构建环境样本多源基因组文库的方法从环境样本中克隆脂肪酶基因相比较，这种利用Genome-Walking直接从环境样本中克隆脂肪酶基因的方法，所需的DNA样本少，而且避免了基因组文库筛选的繁琐工作，为本实验室不可培养微生物、极端环境微生物脂肪酶的开发利用奠定了基础，期望获得一些具有特殊酶学性质脂肪酶的基因。 克隆得到的解脂耶氏酵母脂肪酶基因LIP7与LIP7序列比较有一个碱基的差异，但其编码的氨基酸序列没有发生变化。而LIP8与LIP8序列比较有6个碱基的变异，其中有4个碱基的变化不改变相应的氨基酸序列，另外2个碱基导致编码氨基酸的改变(E74D，Q123L)。蓖麻来源脂肪酶基因LipRC1包含一个1，581bp的ORF，该ORF与Ricinuscommunis脂肪酶基因OBLI有92﹪的同源性。 脂肪酶基因lipB52、lipJ02、lipJ03分别在毕赤酵母中进行了分泌表达，初步确定了其相关酶学性质。 荧光假单孢菌脂肪酶基因lipB52在毕赤酵母KM71中进行分泌表达，重组菌株在诱导的第4天，发酵上清中酶活力达到最高16.6U/mL，纯化后脂肪酶LipB52蛋白达到394.4mg/L发酵上清。将纯化的脂肪酶以p-硝基苯酚酯为底物进行相关的酶学性质分析，脂肪酶LipB52在pH8.0时的最适反应温度为40℃，在其最适反应条件下测得每1mg纯化的蛋白酶活为43.4U。脂肪酶基因lipJ02，lipJ03在毕赤酵母KM71中分泌表达，在诱导的第4天，发酵上清中酶活力分别达到13.6U/mL、15.3U/mL，纯化后脂肪酶LipJ02、LipJ03蛋白分别达到363.4mg/L、386.3mg/L发酵上清。在pH8.0时的最适反应温度分别为30℃、35℃。在最适反应条件下测得每1mg纯化的蛋白酶活分别为42.6U、45.1U。 在脂肪酶酵母展示表达方面，脂肪酶LipB52分别在酿酒酵母和毕赤酵母中实现表面展示，为脂肪酶的全细胞催化奠定了基础。脂肪酶LipB52在酿酒酵母EBY100中进行展示表达，在含半乳糖的YNB-CAA液体培养基中进行诱导表达，诱导48小时后，脂肪酶的活性达最高，最高酶活达92U/g干细胞，展示的脂肪酶表现出较好的稳定性。利用本实验室自主构建的毕赤酵母展示载体，将脂肪酶基因助B52在毕赤酵母KM71中进行展示表达。诱导96小时后全细胞酶活达到最高，毕赤酵母展示脂肪酶Lip52的最适反应温度为40℃，在不同分泌信号作用下展示脂肪酶的全细胞脂肪酶最高酶活，分别为93.56和90.61U/g干细胞。与酿酒酵母展示表达相比，本实验室自主构建的毕赤酵母展示表达载体更适合应用于全细胞催化脂肪酶的展示表达。两者在表达脂肪酶的每克干细胞酶活没有太大的差别，均在每克干细胞90U左右。但由于毕赤酵母可以实现高密度发酵，其每升发酵液的干细胞重量是酿酒酵母每升发酵液中干细胞重量的5倍左右，这样相同体积发酵液中毕赤酵母展示表达的脂肪酶酶活单位远高于酿酒酵母展示表达的脂肪酶酶活单位。另外，脂肪酶在酿酒酵母中是以附加体的形式展示表达，发酵过程必需应用营养缺陷型培养基进行，其启动子PGALI需半乳糖诱导且受葡萄糖的抑制，这样不仅发酵成本高，也不利于发酵条件的优化。脂肪酶在毕赤酵母中展示表达时，目的基因整合到宿主基因组DNA中，可以稳定遗传，其启动子PAOXI受甲醇严格调控，发酵成本低，且利于发酵条件的优化。 另外，本实验还构建了酿酒酵母展示载体pLHJ042，并将脂肪酶基因lipB52、lipB68、lipJ02、lipJ03、LIP7’、LIIP8’、OBL2和LipRC1分别克隆到其中，得到重组质粒。再设计并合成载体同源序列引物进行PCR扩增，得到带有酿酒酵母展示表达载体同源序列的不同来源脂肪酶基因片段。将这些带有酿酒酵母展示表达载体同源序列的不同来源脂肪酶基因片段与经双酶切线性化的酿酒酵母展示表达载体pLHJ042混合物共同转化酿酒酵母INVScl，得到表达突变文库。利用补加RhodamineB的脂肪酶通用底物——橄榄油平板对突变文库进行初步筛选，得到具有活性脂肪酶的突变体。经测序分析表明，不同来源的脂肪酶可以在此系统中实现有效的同源重组得到杂合基因。这种利用酿酒酵母同源重组的特性，结合表面展示技术将突变体的获得与展示表达同步的方法，不仅避免了常规DNAShuffling的复杂操作，而且使有活性的脂肪酶展示于细胞表面，便于突变体文库的高通量筛选，可以作为脂肪酶基因定向进化的新途径。