猪流感病毒（Swine influenza virus,SIV）属于正黏液病毒,能感染不同品种、性别和年龄的猪,并引起发烧、呼吸困难、咳嗽、厌食和消瘦等症状,目前主要流行的猪流感病毒亚型为H1N1和H3N2。另外,猪还具有人源流感病毒和禽源流感病毒都能结合的受体,是人畜共患病的巨大隐患。然而,目前关于猪流感病毒感染的分子机制和调控网络还不清楚。因此,从遗传本质揭示宿主细胞抵御猪流感病毒侵染的分子机制,不仅对筛选抗性基因来提高猪的抗病力有重要意义,而且还能为人畜共患流感病毒的病理研究提供重要的参考和依据。本研究通过构建猪流感病毒（H1N1和H3N2）侵染猪肺泡巨噬细胞系（3D4/21）的细胞模型,首次在全转录组水平构建了猪流感病毒（H1N1和H3N2）侵染猪肺泡巨噬细胞（3D4/21）后相关miRNA、mRNA、lncRNA和circRNA的表达图谱。然后结合生物信息学分析、基因过表达、基因干扰、实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR,qPCR）、双荧光素酶活性检测和RNA免疫共沉淀（RNA immunoprecipitation,RIP）等试验构建了调控H1N1和H3N2侵染3D4/21细胞的2个内源竞争RNA（competing endogenous RNAs,ceRNA）网络。并通过qPCR和酶联免疫吸附剂测定（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）等试验分别鉴定了重要候选分子（miR-10391、TCONS＿00166432和novel＿circ＿0004733）在H1N1和H3N2侵染3D4/21细胞过程中的调控作用。最后通过基因干扰、qPCR、蛋白免疫印迹（western blot）和ELISA等试验鉴定了靶基因M4N2A1在H1N1和H3N2侵染3D4/21细胞过程中的调控作用及可能的分子机制。主要研究结果如下:1.猪流感病毒（H1N1和H3N2）侵染肺泡巨噬细胞系（3D4/21）模型的建立通过不同剂量（1倍TCID50、10倍TCID50和100倍TCID50）的猪流感病毒（H1N1和H3N2）对3D4/21细胞进行不同时间的侵染（24h、48 h和72 h）。结果表明,在同一时间点,100倍TCID50病毒量侵染3D4/21细胞中M和NP基因表达水平均高于10倍和1倍TCID50（P<0.05）。对同一个病毒剂量,M和NP基因表达水平均随时间的增加而增加,并且在48 h处到达显著水平（P<0.05或P<0.01）。在同一时间点,100倍TCID50病毒量侵染3D4/21细胞中病毒相关基因（RIG-I、TLR7和NLRP3）表达水平均高于10倍和1倍TCID50。另外,相对于无病毒侵染组细胞,各细胞因子的分泌水平在H1N1和H3N2侵染后均显著或极显著上升（P<0.05或P<0.01）。并且在100倍TCID50病毒量时,3种细胞因子（IFN-α、IFN-β和IFN-γ）均在48 h处上升,而在72 h处下降。间接免疫荧光检测结果表明,H1N1和H3N2侵染3D4/21细胞48h时的核衣壳蛋白NP表达最强。综上,100倍TCID50侵染3D4/21细胞48 h可以使猪流感病毒H1N1和H3N2入侵细胞进行较好的复制和增殖,并引起宿主细胞较强的免疫应答。因此,本研究选择100倍TCID50病毒量侵染3D4/21细胞48 h作为建模条件,构建猪流感病毒（H1N1和H3N2）侵染猪肺泡巨噬细胞系（3D4/21）的细胞模型,以期进一步分析探讨猪流感病毒侵染3D4/21细胞的分子机制。2.猪流感病毒（H1N1和H3N2）侵染猪肺泡巨噬细胞（3D4/21）后的全转录组测序分析本研究对猪流感病毒H1N1和H3N2侵染3D4/21细胞后的mRNA、lncRNA、miRNA和circRNA进行了鉴定和差异表达分析。跟对照组NC相比,总共筛选出了 119个在H1N1组和H3N2组中共同差异表达的mRNA,并通过qPCR鉴定了其中6个共同差异表达基因——MAN2A1、TBC1D10C、DMN2、SLC27A1、HSPB8 和 NUBPL。总共筛选出了 57个在H1N1组和H3N2组中共同差异表达的lncRNA,并通过qPCR鉴定了其中2个lncRNA——TCONS＿00166432和TCONS＿00087413的转录表达。总共筛选出了22个在H1N1组和H3N2组中共同差异表达的circRNA,并通过qPCR鉴定了其中2个circRNA—novel＿circ＿0004733 和 novel＿circ＿0006303 的转录表达。总共筛选出了5个在H1N1组和H3N2组中共同差异表达的miRNA,并通过qPCR鉴定了其中3个miRNA——miR-10391、miR-450b-5p和novel＿595的转录表达。本研究首次在全转录组水平系统揭示了猪流感病毒（H1N1和H3N2）侵染猪肺泡巨噬细胞（3D4/21）后相关miRNA、mRNA、lncRNA和circRNA的表达图谱。另外,本研究通过生物信息学分析初步揭示差异表达基因参与的信号通路,预测了 lncRNA、miRNA和circRNA可能的靶标及分析其功能富集,为下一步深入研究具体的分子调控机制提供了理论依据和试验基础。3.猪流感病毒（H1N1和H3N2）侵染3D4/21细胞的ceRNA机制研究本研究分别提取3D4/21细胞的细胞核和细胞质RNA,利用qPCR分别检测细胞核和细胞质中TCONS＿00166432和novel＿circ＿0004733的表达水平。结果发现细胞核中TCONS＿00166432表达占49.2%,细胞质中占50.8%。细胞核中novel＿circ＿0004733的表达占12.9%,细胞质中占87.1%。本研究通过序列比对寻找可能的靶向结合位点,结果发现在miR-10391中,种子序列与靶基因MAN2A1完全匹配,与novel＿circ＿0004733有7个碱基匹配,和lncRNATCONS＿00166432有连续7个碱基互补配对,提示其可能存在较强的靶向关系。本研究通过 qPCR 分别检测了 miR-10391-mimics、miR-10391-inhibitor、lnc-pcDNA3.1、lnc-shRNA、circ-pcDNA3.1和circ-shRNA 转染 3D4/21 细胞后 MAN2A1 miR-10391、TCONS＿00166432和novel＿circ＿0004733 的表达水平。结果表明 miR-10391能够负调控MAN2A1基因、TCONS＿00166432和novel＿circ＿0004733的表达,并且MAN2A1基因和TCONS＿00166432的表达趋势一致,提示其可能存在靶向关系。另外,本研究通过双荧光素酶活性检测实验验证了miR-10391对MAN2A1基因、TCONS＿00166432和novel＿circ＿0004733的靶向结合位点转录活性的影响,结果证实miR-10391能靶向MAN2A1基因、novel＿circ＿0004733和TCONS＿00166432。最后,RNA免疫共沉淀实验结果也进一步确证了miR-10391能靶向MAN2A1基因,TCONS＿00166432能靶向MAN2A1基因。4.miR-10391、TCONS＿00166432 和 novel＿circ＿0004733 在猪流感病毒（H1N1 和 H3N2）侵染3D4/21细胞过程中的调控作用本研究发现,病毒侵染3D4/21细胞后,miR-10391-mimics组细胞中病毒相关基因（RIG-I、TLR7和NLRP3）的相对表达水平均发生上调,其中NLRP3的表达差异达到极显著水平（P<0.01）;miR-10391-inhibitor组细胞中3个基因的相对表达水平全部下调,其中TLR7显著下调（P<0.01）。另外,miR-10391-mimics处理显著降低了 IFN-α的分泌水平（P<0.05）。结果表明miR-10391的表达不直接调控流感病毒的复制和增殖,可能参与猪流感病毒侵染后的细胞内免疫应答,上调其表达在一定程度上抑制了免疫应答的强度。本研究发现,相对于仅H3N2侵染组,TCONS＿00166432的过表达显著上调了细胞中NP基因的表达水平（P<0.05）,TCONS＿00166432的干扰显著下调了 NP基因的表达水平（P<0.05）。另外,TCONS＿00166432的过表达显著下调了NLRP3的表达水平（P<0.01）;TCONS＿00166432的干扰显著上调了TLR7的表达水平（P<0.01）。ELISA结果表明,TCONS＿00166432的过表达显著上调了IFN-β和IFN-γ的分泌水平（P<0.05）,TCONS＿00166432的干扰显著下调了细胞中IFN-α的分泌（P<0.05）。这些结果提示,TCONS＿00166432的表达可能直接调控猪流感病毒的复制,并且TCONS＿00166432的低表达可能有利于抑制病毒复制。另外,TCONS＿00166432在一定程度上参与了调控宿主细胞的免疫应答,下调其表达可能在一定程度上有利于3D4/21细胞抵御猪流感病的侵染。本研究发现,novel＿circ＿0004733的过表达显著上调了病毒侵染细胞中NP和M基因的表达水平（P<0.05）,novel＿circ＿0004733的干扰显著下调了H1N1侵染细胞中NP基因的表达水平（P<0.05）。另外,novel＿circ＿0004733的过表达显著下调了H1N1病毒侵染细胞中RIG-I的表达水平（P<0.05）,novel＿circ＿0004733的干扰显著上调了病毒侵染细胞中RIG-I和TLR7（P<0.05）。最后,novel＿circ＿0004733的过表达显著上调了IFN-γ的分泌水平（P<0.05）,novel＿circ＿0004733的干扰显著下调了IFN-γ的分泌水平（P<0.05）。以上结果提示,novel＿circ＿0004733的表达可能直接调控猪流感病毒的复制,并且上调novel＿circ＿0004733的表达可能在一定程度上有利于病毒复制和增殖。另外,novel＿circ＿0004733在一定程度上参与了调控宿主细胞的免疫应答,下调其表达可能有利于3D4/21细胞抵御猪流感病的侵染。5.靶基因MAN2A1在猪流感病毒（H1N1和H3N2）侵染3D4/21细胞过程中的调控作用本研究结合KEGG pathway分析和蛋白互作预测网站的结果,筛出MAN2A1所在的N-聚糖生物合成信号通路（N-Glycan biosynthesis）基因及互作蛋白基因——MAN1A1、MAN1A2、MGAT2 和 MGAT3。通过 qPCR 检测发现,H1N1 和 H3N2 侵染细胞后MAN2A1、MAN1A1、MAN1A2、MGAT2和MGAT3基因的表达水平均发生显著下调（P<0.05）。结果提示3D4/21细胞可能通过抑制整个N-聚糖生物合成信号通路基因的表达来抵御猪流感病毒的侵染。并且MAN2A1干扰显著下调了 N-Glycan biosynthesis信号通路下游基因MGAT2和MGAT3的表达水平（P<0.05）。另外,MAN2A1的干扰直接显著下调了猪流感病毒M基因和NP基因的表达水平（P<0.05）,但对猪流感病毒侵染3D4/21细胞后细胞中病毒相关基因（RIG-I、TLR7和NLRP3）的表达水平没有显著影响（P>0.05）,提示MAN2A1的表达可能主要调控猪流感病毒的复制和增殖,而不是主要通过先天免疫应答来调控猪流感病毒的侵染。ELISA结果表明,MAN2A1的干扰显著下调了病毒侵染后细胞中IFN-α的分泌水平（P<0.05）,提示MAN2A1的表达在一定程度影响了细胞免疫应答。本研究发现通路抑制剂衣霉素处理3D4/21细胞后抑制了整个N-Glycan biosynthesis.信号通路基因（MAN2A1、MAN1A2、MGAT2 和 MGAT2）的表达（P<0.01）,并显著下调了病毒M基因和NP基因的表达水平,提示衣霉素可能通过阻遏N-Glycan biosynthesis信号通路进而调控猪流感病毒的复制和增殖,和MAN2A1基因干扰产生的效应类似。这些结果提示MAN2A1基因在3D4/21抵御猪流感病毒（H1N1和H3N2）侵染的过程中发挥了重要的调控作用,并且MAN2A1基因可能通过介导N-Glycan biosynthesis信号通路直接调控病毒的复制和增殖。最后,本研究鉴定了MAN2A1基因的3段核心启动子区,并发现位于第2段核心启动子区SNP位点的A/T突变能显著增强MAN2A1基因的转录活性（P<0.05）,提示MAN2A1基因该变异位点能影响转录因子的结合,从而调控MAN2A1基因转录和表达。综上,本研究首次报道了猪流感病毒侵染3D4/21细胞过程中参与调控的ceRNA网络并确定了其可能的调控机制,为揭示3D4/21细胞抵御猪流感病毒侵染的分子机制提供了全新的见解。