目的:2013年5月8日,国务院总理李克强在国务院常务会议中特别提出“严厉打击肉类产品掺假售假等违法违规行为”。从2013年1月欧洲马肉事件到近期报道的鼠肉冒充羊肉串和狐狸肉冒充牛羊肉等等,“掺假肉”不停地冲击着肉品市场,带来了巨大的负面影响。其中最值得关注的是掺杂鼠肉、狐狸肉、貉子肉和貂肉。由于在饲养皮毛动物的过程中缺乏严格的检疫程序,其肉源可能携带大量细菌、病毒、寄生虫及过敏源。此外,为了保证皮毛的质量,喂养皮毛动物的饲料中含有大量的重金属、激素、抗菌素以及抗病毒药物等物质,造成此类肉源内有毒有害物质严重超标,食用此类肉源将会对人的健康产生巨大的危害。在监管鼠、狐狸、貉子和貂肉源性成分方面,我国面临的三个困境。第一,虽然我们必须严格遵守我国行政法规和法律依据实施监管,但是目前我国并没有明确的法律规定鼠肉、狐狸肉、貉子肉、貂肉等不得食用。第二,虽然食品监管部门应该对此种肉类掺假问题进行严格监管,但是我国掺杂肉鉴别检测标准存在着较大空白,尤其像鼠、狐、貉和貂这些特殊的肉源成分。目前,我国尚无统一的检测方法和标准,且在现有检测其他肉源性成分的标准体系中也没有可以同时检测多种源性成分的检测方法和标准。第三,由于肉类产品具有流通量大和保质期短等特点,在实验室条件下常用的定量和定性检测方法很难满足实时的、快速的、大批量产品检测的需求,因此亟待开发出高通量、快速、便捷、准确的肉源性成分的快速检测技术及产品。本论文基于国家食品监管的完善和肉品市场的检测需求,结合本实验室的快速核酸识别技术优势,以鼠、狐狸、貉子、貂肉源性成分为研究对象,开展了肉源性成分快速检测技术的研究与应用。方法:1、本研究利用生物信息学技术确定了具有特异性的核酸序列,用以作为检测的基因靶点。2、利用引物设计软件Primer5.0、DNAMAN和Primer Explorer V4,设计了一系列的引物,并对其特异性进行了筛选和验证。3、利用动物血液/细胞/组织DNA提取试剂盒提取靶基因的DNA。4、利用紫外-可见光谱确定DNA含量。5、利用琼脂糖凝胶电泳分析了PCR、MPCR、LAMP、RCA扩增产物和酶切产物。6、利用等温环介导方法筛选扩增引物,并对影响LAMP反应的主要因素进行了单因素考察,确定最佳LAMP反应体系。7、利用滚环复制扩增(RCA)方法对设计的识别探针的特异性和有效性进行筛选。8、利用正交实验方法优化DNAzyme过氧化发光信号放大体系实验条件。结果:1、建立了检测鼠、狐狸、貉子、貂肉源性成分的PCR和多重PCR的方法。通过GeneBlast比对,设计并筛选出了四对鼠、狐狸、貉子、貂特异性引物,获得了分别为285bp、744bp、622bp和395bp的PCR扩增产物。利用DNA基因测序和限制性核酸内切酶验证了PCR扩增产物的特异性。测序结果与GeneBank收录的序列具有高于98%的序列同源性,从而建立了用于检测鼠、狐狸、貉子、貂肉源性成分的四种PCR方法和PCR-RFLP方法。运用上述四对引物和文献报道的用于牛肉源性成分检测的PCR引物和用于羊肉源性成分检测的PCR引物,开发出了检测牛肉中和羊肉中掺杂鼠、狐狸、貉子、貂肉源性成分的2重、3重和4重PCR检测方法。该方法可在一个反应中同时检测多种肉源性成分,实现了高通量快速检测,检出限不低于1%(w/w),可以满足现场检测的要求。2、建立了检测鼠源性成分的新型LAMP方法。通过GeneBlast比对,筛选出鼠的特异性基因片段;针对该片段设计了LAMP引物并进行改进,利用荧光定量检测和荧光目测比色法对扩增产物进行比对检测。通过优化引物特异性、引物比例、引物浓度、模板浓度等反应条件,从4组引物中成功筛选出了1组鼠源性成分的等温扩增引物。在优化的条件下(反应温度为63℃,引物比例为1:2:8摩尔比,模板浓度为2~5ng/μL),该方法的检出限不低于1%(w/w)。采用同样方法,从4组套狐狸源性成分LAMP引物中成功筛选出了1组狐狸源性成分的LAMP引物。在优化的条件下(反应温度为63℃,引物比例为1:3:10摩尔比,模板浓度为2~5ng/μL),该引物出现检测阈值时间仍大于30min,表明LAMP引物结构需要进一步优化。采用同样方法对3组貉子和2组貂,源性成分的LAMP引物进行了筛选。但是,没有获得理想的貉子和貂源性成分的LAMP引物。3、建立了检测鼠肉源性成分的RCA方法。通过GeneBlast分析,确定了鼠的16s核糖体亚基的特异性片段作为靶标片段,并针对该靶标片段设计了RCA锁式探针。以鼠源性成分的S系列锁式探针为基础,对环化连接酶进行了筛选,考察了T4 DNA连接酶、连接时间、锁式探针结构、目标基因片段切割点、靶标片段点突变对RCA扩增效率的影响。此外,本实验还考察了phi29 DNA聚合酶扩增体系和Bst DNA聚合酶扩增体系的检测效率,考察了随机引物长度对RCA扩增效率的影响,并最终确定了该检测体系的最适条件。在此基础上,本实验利用RCA体系筛选了S系列、RC体系和FC体系的鼠肉源性成分识别锁式探针。实验结果表明,所设计的锁式探针具有很高的识别效率,并得到了酶切反应的验证,为鼠肉源性成分的RCA快速鉴别奠定技术平台基础。4、建立了检测狐狸肉源性成分的DNAzyme的方法。通过GeneBlast比对,确定了狐狸12s核糖体亚基上特异性基因片段为靶标片段。针对上述基因片段,设计了3组分别含有与靶标片段互补序列和2个富含G岛结构的识别探针对。通过正交试验,对DNAzyme检测体系进行了优化,确定了该检测体系的最适条件。经过实验验证,该方法目测结果与光谱测定结果一致,可实现裸眼可视化检测。由于该方法不需要特殊仪器设备,操作简便,易于实现推广和现场检测,具有较高的开发价值。结论:本论文针对国家亟待解决的掺假肉食品安全问题,开展了鉴别鼠、貂、狐狸、貉子肉源性成分的实验研究。本论文成功地建立了一系列可以同时检测牛羊肉中貂、狐狸、貉子肉源性成分的PCR和MPCR方法,实现了高通量快速检测;基于LAMP原理对LAMP引物进行结构改造,建立了新型的LAMP方法,极大地降低了反应的非特异性扩增,并首次成功的建立了肉品中鼠源性成分的新型LAMP鉴别方法,该方法快速、高效、灵敏度高,适用于现场检测需求。首次将滚环扩增(RCA)技术和DNAzyme裸眼可视化显色体系应用在肉源性成分鉴别领域中,为肉源性成分快速鉴别提供了可靠的实验基础。