目的：　　 卵巢癌是女性生殖器官三大恶性肿瘤之一，至今缺乏有效的诊治方法，其五年生存率仍较低，徘徊在25％-30％之间。随着宫颈癌和子宫内膜癌诊断和治疗的进展，卵巢癌已成为严重威胁妇女生命的肿瘤，其死亡率高居妇科恶性肿瘤之首。究其原因，70％以上的卵巢癌诊断时，病变范围已超出卵巢，发生转移。尽管努力提高了卵巢癌的早期诊断率和手术、化疗水平，但是卵巢癌的转移问题仍然面临着巨大挑战，流行病学调查显示，在有较高体重指数(BMI)的年轻成人具有绝经期前卵巢癌增加的危险性。美国一项最新研究结果显示，肥胖女性患卵巢癌后的死亡率比正常体重患者要高。该研究对216名患卵巢癌的女性进行了比较研究，其中35人为肥胖者，108人体重正常。研究结果表明，肥胖患者不仅存活率低，而且接受治疗后癌症复发的几率也高，原因可能为它们的脂肪组织会分泌一种激素或蛋白质，导致卵巢癌细胞过度生长。　　 抵抗素是一种新型的激素，是由人类脂肪细胞、单核细胞分泌的，与肥胖、胰岛素抵抗和炎症相关。在人类，抵抗素不仅由脂肪细胞表达分泌，还可由外周血单核细胞表达。流行病学调查显示，人血浆抵抗素水平与体重指数呈正相关关系。除对胰岛素信号途径的作用外，抵抗素具有较高的致炎性，有学者研究显示抵抗素在诸多癌症中存在高表达，如:结肠癌、直肠癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、前列腺癌等，在妇产科疾病如:多囊卵巢综合症、子宫内膜异位症、子宫肌瘤、子宫内膜癌、绒毛癌等中均存在高表达，那么抵抗素是否在卵巢癌中存在高表达？是否为肥胖患者卵巢癌患病率和死亡率增加的靶点？文献检索尚无此方面报道。　　 本部分研究将应用多种分子生物学、生理学、生物化学等技术，以卵巢上皮癌细胞系HO-8910为研究对象，探讨抵抗素促进卵巢癌细胞增殖、迁移及促进血管新生的机制。抵抗素抗血管生成疗法是否可以应用于对卵巢上皮癌的治疗，尤其是肥胖病人。　　 实验材料及方法　　 第一部分:(1)应用不同时间、不同浓度的抵抗素作用于卵巢癌细胞HO-8910，MTT法检测细胞增殖功能;(2)利用siRNA敲除脂肪细胞中的抵抗素，转移条件培养基培养卵巢癌细胞HO-8910，通过MTT法检测细胞增殖功能;(3)利用免疫印迹法检测抵抗素HO-8910细胞后mTOR及其下游靶蛋白S6总蛋白及磷酸化蛋白量的变化;(4)应用不同时间、不同浓度的抵抗素作用于卵巢癌细胞HO-8910，划痕实验检测细胞迁移功能;(5)利用siRNA敲除脂肪细胞中的抵抗素，细胞共培养及条件培养基培养卵巢癌细胞HO-8910，划痕实验检测细胞迁移功能。　　 第二部分:(1) HO-8910细胞与内皮细胞共培养，利用内皮细胞成管实验来验证抵抗素是否可以影响内皮细胞的成管特性，诱导血管生成，在此系统中加入VEGF中和抗体作用后，检测成管作用;(2)实时定量PCR的方法检测抵抗素对HO-8910细胞及以抵抗素中和抗体中和外源性加入的抵抗素对VEGF mRNA表达水平的影响(3) ELISA法检测HO-8910细胞培养基上清中VEGF多肽水平;(4)双荧光素酶报告基因检测VEGF启动子的活性。　　 第三部分:(1)利用免疫印迹法检测PI3K的亚单位p85及Akt在Ser473位点及磷酸化蛋白量的变化;用LY294002和wortmannin预处理细胞后，通过实时定量PCR方法来检测抵抗素诱导的VEGFmRNA表达的情况，ELISA法检测培养基上清中VEGF的分泌的情况;(2)双荧光素酶报告基因检测抵抗素诱导的VEGF启动子的活性，给予其抑制剂后其活性的变化;(3)免疫印迹法检测了Sp1在Thr-453和Thr-739位点及磷酸化蛋白量的变化;ChIP-PCR分析抵抗素对Sp1与VEGF启动子上的预测Sp1位点的结合能力。(4) EMSA法检测HO-8910细胞核蛋白的DNA-结合蛋白的活性;(5)用LY294002和wortmannin预处理细胞后，免疫印迹法检测抵抗素诱导的Sp1在Thr-453和Thr-739位点及磷酸化蛋白量的变化。双荧光素酶报告基因检测Sp1的活性。　　 实验结果　　 第一部分:MTT法检测抵抗素对HO-8910细胞的作用，结果表明:抵抗素可以呈时间、剂量依赖性的促进HO-8910细胞的增殖。接下来我们利用siRNA敲除脂肪细胞中的抵抗素，培养原代脂肪细胞或Cos-7细胞（作为阴性对照），将收获的条件培养基用以孵育HO-8910细胞，结果表明:脂肪细胞条件培养基可显著促进HO-8910细胞的增殖，如果在脂肪细胞培养过程中给予特异性敲低抵抗素，则脂肪细胞条件培养基促增殖的作用明显被削弱。进一步对抵抗素促HO-8910细胞增殖的可能机制进行探讨，发现抵抗素可能通过激活mTOR及其下游信号分子促进HO-8910细胞的增殖。划痕实验检测抵抗素对HO-8910细胞的迁徙作用，结果表明:抵抗素能促进HO-8910细胞的迁移，且呈时间和剂量依赖性。与脂肪细胞共培养的HO-8910细胞划痕愈合能力明显增强;如果在共培养系统中特异性敲除脂肪细胞抵抗素，则愈合能力明显被削弱。培养原代脂肪细胞或Cos-7细胞（作为阴性对照），将收获的条件培养基用以孵育HO-8910细胞，结果显示与Cos-7细胞条件培养基相比，脂肪细胞条件培养基可显著促进HO-8910细胞的划痕愈合能力;同样，如果在脂肪细胞培养过程中给予特异性敲低抵抗素，则脂肪细胞条件培养基促划痕愈合的作用明显被削弱。　　 第二部分:内皮细胞成管实验显示:抵抗素在体外可诱导卵巢癌血管生成，VEGF中和抗体可减弱抵抗素的促成管作用;实时定量PCR检测抵抗素对HO-8910细胞VEGF mRNA表达水平的影响，结果表明100 ng/ml抵抗素处理24h后可上调VEGFmRNA水平达7.6倍，我们以抵抗素中和抗体中和外源性加入的抵抗素，结果发现抵抗素中和抗体可以抑制抵抗素对VEGF的表达;ELISA法检测HO-8910细胞培养基上清中VEGF多肽水平，刺激24小时后，25-150 ng/ml抵抗素均可显著增加培养基上清中VEGF含量，且呈剂量依赖性变化，同时抵抗素可显著诱导VEGF启动子报告基因的荧光素酶活性，在25 ng/ml时既已有明显作用，100 ng/ml时作用更加显著。　　 第三部分:抵抗素刺激1h后，磷酸化的p85和Akt(Ser473)均显著被诱导，给予LY294002或wortmannin(PI3K/Akt通路的特异性抑制剂)均可明显阻断100ng/ml抵抗素诱导的VEGFmRNA表达，培养基上清中VEGF的分泌也得到类似的结果。给予PI3K/Akt通路的特异性抑制剂LY294002或wortmannin均可明显阻断100 ng/ml抵抗素诱导的VEGF启动子活性。我们用免疫印迹法检测Sp1在Thr-453和Thr-739位点的磷酸化，抵抗素刺激1h后显示:抵抗素增强VEGF启动子转录因子SP1的活性，抵抗素可显著诱导含有Sp1结合位点的VEGF启动子片段的荧光素酶活性，也可以直接诱导Sp1报告基因pLuc Sp1的荧光素酶活性，但不能诱导不含Sp1结合位点的VEGF启动子片段的荧光素酶活性。 ChIP-PCR分析提示，抵抗素可诱导Sp1与VEGF启动子上的预测Sp1位点的直接结合。EMSA法显示:抵抗素增强DNA-结合蛋白的活性;用LY294002和wortmannin预处理HO-8910细胞后，可显著削弱抵抗素诱导的Sp1在Thr-453和Thr-739位点的磷酸化，LY294002和wortmannin也可以显著削弱抵抗素诱导的pLuc Sp1荧光素酶报告基因的活性。　　 结论：　　 第一部分:(1)抵抗素可能通过激活mTOR及其下游信号分子促进HO-8910细胞的增殖;(2)抵抗素可促进HO-8910细胞的迁移。　　 第二部分:(1)抵抗素上调HO-8910细胞中VEGF mRNA的表达，并呈时间和剂量依赖性;(2)抵抗素增强VEGF启动子的活性;(3) VEGF介导了抵抗素诱导卵巢癌血管生成的作用。　　 第三部分:(1)抵抗素可激活PI3K/Akt信号通路;(2)PI3K/Akt信号通路介导了抵抗素对VEGF表达、分泌和转录的上调;(3)抵抗素可激活转录因子c;(4)转录因子Sp1介导了抵抗素对VEGF启动子活性的上调;(5)抵抗素通过PI3K/Akt信号途径激活Sp1。