【摘 要】
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目的:本研究以人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVEC）为模式细胞,研究人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin,hCG）对VEGF-MEK/ERK信号通路相关因子表达以及对HUVEC增殖、迁移、侵袭、小管生成能力的影响,探讨VEGF-MEK/ERK信号通路在hCG诱导HUVEC血管生成中的作
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目的:本研究以人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVEC）为模式细胞,研究人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin,hCG）对VEGF-MEK/ERK信号通路相关因子表达以及对HUVEC增殖、迁移、侵袭、小管生成能力的影响,探讨VEGF-MEK/ERK信号通路在hCG诱导HUVEC血管生成中的作用。方法:体外培养HUVEC,给予hCG和PD98059（MEK/ERK信号通路抑制剂）处理。（1）采用CCK-8和小管形成实验,确定作用剂量及分组:对照组、hCG处理组（50 IU/m L）、PD98059处理组（10μM）和PD98059+hCG联合处理组（10μM PD98059预处理30 min后加50 IU/m L hCG）。（2）采用CCK-8、划痕实验、侵袭实验和小管形成实验分别检测不同处理组HUCEC的增殖、迁移、侵袭和成管能力。（3）RT-q PCR检测VEGF-MEK/ERK信号通路VEGF、VEGFR2、RAS、MEK1/2、ERK1/2 m RNA的相对表达水平。（4）采用Wes全自动蛋白定量表达分析系统检测VEGF-MEK/ERK信号通路相关蛋白VEGF、VEGFR2、RAS、MEK1/2、p-MEK1/2、ERK1/2、p-ERK1/2的相对表达水平。（5）采用免疫荧光定位细胞中p-ERK1/2的位置。结果:（1）hCG诱导HUVEC增殖和成管:12.5、25、50、100 IU/m L hCG作用HUVEC 24 h后细胞存活率显著增强（P＜0.05）,其中25和50 IU/m L hCG促增殖能力最强,200 IU/m L hCG无明显作用;小管形成实验结果显示:50 IU/m L hCG小管分支数与总主干长度均显著增高（P＜0.05）。（2）PD98059抑制HUVEC增殖和成管:10、20、40μM PD98059作用HUVEC 24 h后细胞活力呈剂量依赖性下降（r=-0.907,P＜0.05）;小管形成实验结果显示:10、20、40μM PD98059小管分支数与总主干长度均显著降低（P＜0.05）。（3）HUVEC生物学功能:50IU/m L hCG可显著增强HUVEC的增殖、迁移、侵袭、成管能力（P＜0.05）,10μM PD98059可显著抑制HUVEC的增殖、迁移、侵袭、成管能力（P＜0.05）,与hCG处理组相比,PD98059+hCG联合处理组HUVEC增殖、迁移、侵袭、成管能力显著下降（P＜0.05）。（4）VEGF/VEGFR2信号通路相关因子表达情况:（1）m RNA表达水平:与对照组相比,hCG处理组VEGFA、VEGFR2 m RNA的相对表达水平无显著差异。（2）蛋白表达水平:与对照组相比,hCG处理组VEGFA、VEGFR2的蛋白相对表达水平均明显增加（P＜0.05）。（5）MEK/ERK信号通路相关因子表达情况:（1）m RNA表达水平:各组间RAS、MEK1/2、ERK1/2 m RNA表达水平无显著差异。（2）蛋白表达水平:与对照组相比,hCG处理组RAS的相对表达水平明显增加（P＜0.05）;各组间MEK1/2蛋白表达水平无显著差异;经hCG处理后,ERK1/2的蛋白表达水平无明显差异,p-MEK1/2和p-ERK1/2蛋白水平显著增高,p-MEK/MEK、p-ERK/ERK比值增大（P＜0.05）;经PD98059处理后,ERK1/2、p-MEK1/2和p-ERK1/2的蛋白表达量明显下降,p-MEK/MEK比值同时下降（P＜0.05）;与hCG处理组比较,PD98059+hCG联合处理组p-MEK1/2和p-ERK1/2的表达显著下降,且p-MEK/MEK和p-ERK/ERK的比值均减小（P＜0.05）。（6）免疫荧光结果表明:hCG可使p-ERK1/2表达水平增强且向核内转移,经PD98059处理后,p-ERK1/2较少入核并表现为弱表达。上述结果提示:hCG可激活VEGF-MEK/ERK信号通路,并使p-ERK向核内转移。结论:hCG可能通过激活VEGF-MEK/ERK信号通路,促进HUVEC增殖、迁移、侵袭、成管,影响孕早期血管生成。
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