目的:脓毒症是因感染而引起宿主反应失调进而危及生命的器官功能障碍综合征,为成人及儿童重症监护病房常见疾病之一,某些脓毒症患者会发生循环和代谢异常从而出现脓毒性休克,具有极高的病死率。研究发现,心脏是儿童脓毒症所致的多器官功能障碍的主要靶器官之一,脓毒症及脓毒性休克时常常诱发不同程度的心功能障碍,称之为脓毒症诱导的心肌抑制。脓毒症心肌抑制的发病机制尚不明确,当前研究认为细胞凋亡可能在脓毒症心肌抑制的发病机制中扮演了重要的角色,然而在脓毒症心肌抑制中有关细胞凋亡的详尽过程尚不明确。长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是在真核生物中发现的长度超过200个核苷酸、没有长阅读框架、但往往具有mRNA结构特征的一类RNA。目前认为lncRNA在体内主要起到参与调控转录激活、转录干扰等多种重要过程的作用。然而,lncRNA与脓毒症心肌抑制相关的研究鲜有报道,lncRNA是否参与调控脓毒症心肌抑制尚不明确。本研究将从lncRNA角度出发,探索lncRNA是否可通过调节细胞凋亡参与到脓毒症心肌抑制的病理生理过程之中。研究方法:本研究采用LPS腹腔注射的给药方法建立脓毒性休克大鼠模型,采用H&E染色对比脓毒性休克组大鼠和对照组大鼠心肌病理改变的同时,利用ELISA检测脓毒症组与对照组中炎症指标(TNF-α和IL-6)以及心肌酶(cTnI和CK-MB)改变情况,并通过TUNEL染色检测两组大鼠心肌细胞凋亡情况。利用高通量测序技术对比脓毒症(6只)和对照组(6只)大鼠心肌组织中lncRNA及mRNA表达差异情况,利用生物信息学对测序结果进行深入分析。为了验证高通量测序结果的准确性,我们在动物水平对lncRNA进行扩大样本量的qPCR验证(每组n=15只)。为了深入探究lncRNA在脓毒症心肌抑制中的调控机制,我们选取来自Pvt1基因的转录本,将其命名为lncRNA rPvt1进行深入研究。我们通过设计特异性探针采用荧光原位杂交技术(Fluorescence in situ hybridization,FISH)对其在大鼠心肌组织中进行表达定位分析并利用cDNA末端快速扩增技术(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)获取了lncRNA rPvt1的全长,采用慢病毒构建了lncRNA rPvt1的沉默和过表达载体,在细胞水平通过LPS诱导H9c2大鼠心肌细胞系建立了脓毒症心肌抑制的细胞模型,探索lncRNA rPvt1对细胞凋亡、细胞增殖和细胞周期的影响。通过生物信息学的进一步预测,我们发现lncRNA rPvt1下游的靶基因可能为p53、c-Myc、Myd88以及Bid,为了探究lncRNA rPvt1对细胞凋亡的影响,我们同时选择了其他参与细胞凋亡且与预测靶基因相关的基因进行检测(Caspase-3、Bax和Bcl-2)。我们分别在大体水平和细胞水平利用qPCR、免疫组化和Western blot等实验技术在mRNA和蛋白水平检测了以上基因的表达情况,随后对lncRNA rPvt1进行了靶向干预(沉默或过表达),检测lncRNA rPvt1对靶基因及各凋亡相关蛋白的影响及调控作用。为了深入探究lncRNA rPvt1在脓毒症心肌抑制中的调控机制,我们采用RNA-pull down联合质谱分析检测lncRNA rPvt1可结合蛋白情况。最后为了探索lncRNA rPvt1在脓毒症心肌抑制中呈现高表达的原因,我们预测了转录因子DDIT3可能为Pvt1基因的上游,随后采用染色质免疫沉淀技术(Chromatin Immunoprecipitation assay,ChIP)及双荧光素酶实验检测转录因子DDIT3对Pvt1基因的调控作用,阐明DDIT3与Pvt1基因之间的调控关系。结果:第一部分:我们发现脓毒症大鼠心功能在注射LPS后逐渐呈现下降趋势,注射LPS 2h后达到脓毒性休克标准并可持续至12h。通过H&E染色发现与对照组相比,脓毒性休克组大鼠左心室肌存在明显的心肌组织断裂及炎性细胞浸润,心肌损伤情况较对照组大鼠严重;造模12h后分别选取脓毒性休克大鼠模型和对照组大鼠动脉血进行炎症指标和心肌酶检测,与对照组大鼠相比,脓毒性休克组大鼠动脉血中的炎症指标(TNF-α和IL-6)以及心肌酶(cTnI和CK-MB)在12h呈现明显上升趋势(P﹤0.05);并通过TUNEL染色证实了与对照组大鼠相比,脓毒症心肌抑制组大鼠心肌细胞凋亡数量显著升高(P﹤0.05)。通过对脓毒性休克组和对照组大鼠心肌组织进行测序,在两组中共筛选出74个显著差异表达lncRNA和4011个显著差异mRNA,利用生物信息学分析发现细胞凋亡通路显著富集,说明细胞凋亡在脓毒症心肌抑制中发挥了重要作用。第二部分:通过在大体水平扩大样本量验证,证实了本次高通量测序具有较高的准确性,并选择在脓毒症组中高表达的lncRNA rPvt1进行后续功能研究。通过FISH染色发现lncRNA rPvt1在细胞核和细胞质均有表达,并通过Northern blot和RACE克隆获取了lncRNA rPvt1序列全长。通过细胞功能实验发现lncRNA rPvt1主要影响细胞凋亡:在LPS诱导24h和48h后的H9c2心肌细胞系中,与空转组相比,沉默lncRNA rPvt1后心肌细胞凋亡显著增加(P﹤0.05),过表达后细胞凋亡数量显著下降(P﹤0.05),说明lncRNA rPvt1在脓毒症心肌抑制中可通过影响细胞凋亡从而扮演了重要的角色。第三部分:通过在大体水平和细胞水平研究,发现与对照组相比,c-Myc、cleaved-Bid、cleaved-Caspase 3和Bax蛋白在脓毒性休克组中呈现高表达(P﹤0.05),Bcl-2蛋白呈现低表达(P﹤0.05),而p53蛋白在两组中的表达无显著差异(P>0.05)。通过在细胞水平干预lncRNA rPvt1(沉默或过表达),证实lncRNA rPvt1与c-Myc、cleaved-Bid、cleaved-Caspase 3、Bax蛋白具有负向调控作用,对Bcl-2和Myd88具有正向调控作用。通过RNA-pull down和后续验证实验,发现在脓毒症心肌抑制中lncRNA rPvt1通过IL-1/IL-1R/Irak-2信号通路调控Myd88。最后我们通过ChIP和双荧光素梅实验证实了DDIT3可与Pvt1基因启动子区域靶向结合并在两组中具有不同的结合活性:与对照组相比,脓毒症心肌抑制组中DDIT3对Pvt1基因的调控显著增强。结论:1.通过高通量测序技术发现lncRNA在脓毒症心肌抑制中发挥了重要的作用。并通过进一步生物信息学预测,发现细胞凋亡及其相关通路可能成为脓毒症心肌抑制中心功能下降的重要原因和潜在机制。2.lncRNA rPvt1在脓毒症心肌抑制中呈现显著升高趋势,并在细胞水平证实了lncRNA rPvt1主要参与并调控心肌细胞的细胞凋亡过程,在脓毒症心肌抑制中可能扮演了保护角色。3.通过进一步探讨lncRNA rPvt1的下游靶基因,发现了lncRNA rPvt1虽然可通过IL-1R/Irak-2/Myd88信号通路在一定程度上增加炎症反应,但可通过调控靶基因c-Myc和Bid进而影响Caspase-3,Bax及Bcl-2蛋白表达,对细胞凋亡产生更为显著的调控作用,从而在疾病中起到抑制细胞凋亡的保护作用。同时,我们发现lncRNA rPvt1在脓毒症心肌抑制中的表达升高可能与转录因子DDIT3相关,转录因子DDIT3可能成为lncRNA rPvt1表达升高的原因。