实验一自制KYL液的配制目的;通过调整渗透压重新配制肝脏保存液(KYL液),为下一步实验做好准备。方法:按照配方将成份浓度换算成重量比,经电子天平精确称量,以对应体积蒸馏水完全溶解,无菌过滤纸过滤残渣,经真空过滤泵过滤,反复测量PH值、渗透压,装袋低温保存。所有操作在无菌配液室进行。结果:经多次试验,配制成PH值7.4±0.05,渗透压340±5mmol/L的淡棕色,半透明,无浑浊,无沉淀及絮状物保存液。结论:掌握了配制KYL液的实验方法,成功配制成价格低廉,性能稳定的自制器官保存液,为下一步实验奠定了基础。实验二:恒河猴同种异体原位肝移植模型的建立目的:建立恒河猴肝移植模型,为进一步的实验奠定基础。方法:健康恒河猴16只,体重5-7kg,雌雄不限,供体体重略小于受体,用非静脉转流的方法建立恒河猴原位肝移植模型。整个实验主要步骤大致分为;1供体组手术,主要包括供体血采集、经门静脉及腹主动脉插管行非离体肝脏灌注及供肝的切取;2供肝修整:3受体肝脏的切除及新肝的植入。结果:8次肝移植实验中,手术成功率100%。5例因肝动脉直径不到1mm均行腹主动脉肝动脉搭桥,3例行肝动脉端端吻合。存活时间均超过6小时,最长达9小时。结论:恒河猴肝移植模型难度大,影响因素多,熟练的外科技术,完善的围手术期处理及耐心细致的操作是决定手术成功与否的关键。本实验小组成员有丰富的大鼠肝移植及临床肝移植经验,已经充分掌握了肝移植技术,是手术成功(100%)的主要原因。但是由于实验条件较差,麻醉深浅难以控制,是肝移植术后恒河猴不能长期存活的主要原因。实验三肝移植实验部分目的:通过对比分析探讨自制KYL液对恒河猴肝脏缺血再灌注后的保存效果。方法:本实验以上一实验步骤为基础,分为KYL液灌注并保存组4例(实验组),Uw液灌注并保存组4例(对照组)。供肝体外冷保存4小时后,行同种异体原位肝移植术,分别于肝脏复流后30分钟、6小时时段,记录胆汁分泌量,经股动脉采血检测AST、ALT、NO、ET—1、TNF—α浓度。切取肝组织行光镜、电镜组织形态学观察,并行免疫组化检测凋亡相关因子Bcl—2,Bax,Fas表达情况。结果:两组术后均有胆汁分泌,随时间延长胆汁分泌量增加:血清AST、ALT浓度,KYL液组在两个时间段均较UW液组稍低;血清NO浓度两组各时间段相当;血清ET—1浓度两组各时间段相近;血清TNF—α浓度两组各时间段相近;光镜、电镜肝组织形态学观察各时间段变化基本一致;免疫组化染色两组均呈现Bcl—2微弱表达,Bax,Fas则明显表达。结论:1从胆汁生成量分析,KYL液对肝脏的保存效果与UW液相当。2从肝功酶学分析,KYL液对肝脏的保存效果优于UW液。3从肝脏缺血再灌注损伤相关因子NO、ET—1、及TNF—α分析,KYL液对肝脏的保存效果与UW液相当。4从组织形态变化及凋亡相关因子分析,KYL液对肝脏的保存效果与UW液相当。实验四非循环离体灌注肝脏冷保存实验目的:通过对比分析探讨自制KYL液对恒河猴肝脏的冷保存效果。方法:将上一实验过程中受体切下的8例肝脏,随机分为KYL液组4例(实验组),UW液组4例(对照组)。在肝脏切下后经门静脉快速灌注保存液至肝脏颜色变成浅黄色,同时行肝动脉及胆道冲洗,灌洗完毕保持并减慢静脉灌注速度(30滴/分),肝脏进入冷保存阶段,保存温度0—4℃。分别于冷保存2、4、8、16、24小时时段记录胆汁分泌量,取灌注流出液检测AST、ALT、NO、ET—1、TNF—α浓度。切取肝组织行光镜、电镜组织形态学变化观察,并行免疫组化染色,检测凋亡相关因子Bcl—2、Fas、Bax的表达情况。结果:两组冷保存肝脏在冷保存过程中均有胆汁分泌,但随着保存时间的延长,胆汁分泌量逐渐减少。灌注流出液中AST、ALT浓度随保存时间延长而逐渐升高,在2、4、8、16时间段,两组保存液中测得的浓度相近,24小时段UW液组AST、ALT明显升高;NO浓度随保存时间延长呈下降趋势,但KYL液组各时间段所测得的NO浓度较UW液稍高:ET—1浓度随保存时间延长逐渐升高,但KYL液组各时间段所测得的ET—1浓度较UW液组稍低:TNF—α浓度随冷保存时间延长而有所上升,两组所得浓度值相近。肝脏组织形态学变化基本一致。免疫组化显示Bcl—2表达呈下降趋势,但UW液组下降较明显,Bax、Fas两组均明显表达。结论:1从胆汁生成量分析,KYL液对肝脏的冷保存效果与UW液相当。2从肝功酶学分析,KYL液对肝脏的冷保存效果在2、4、8、16小时时间段与UW液基本相当,在24小时段明显优于UW液。3从肝脏缺血再灌注损伤相关因子分析,KYL液对肝脏的冷保存效果,即对肝脏微循环,肝窦内皮细胞的保护效果优于UW液。4从组织形态变化及凋亡相关因子分析,KYL液对肝脏的冷保存效果与UW液相当。