【摘 要】
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禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)引起在临床上主要是鸡的关节炎/腱鞘炎。但近年来,研究者发现ARV感染还可导致鸡的包括临床和亚临床免疫抑制。因此,对ARV感染的检测与诊断
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禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)引起在临床上主要是鸡的关节炎/腱鞘炎。但近年来,研究者发现ARV感染还可导致鸡的包括临床和亚临床免疫抑制。因此,对ARV感染的检测与诊断显得十分重要。ARV共编码15个蛋白,其中σ3蛋白是由S1基因编码的细胞吸附蛋白,是唯一能从ARV感染细胞提取并能特异地吸附到禽类细胞上的病毒蛋白,σ3蛋白能完全阻断ARV对细胞的的结合,说明了σ3蛋白吸附宿主细胞是特异性和饱和性的,是诱导产生中和抗体的有效抗原。因此本课题利用基因克隆技术体外表达σ3蛋白并应用表达的融合蛋白作为抗原建立ELISA检测技术。 参考GeneBank上S1133株S1的基因序列,设计合成7—对含有酶切位点的引物,对ARV的S1133株的S1基因进行PCR扩增,扩增一段1014bp的基因片断,然后克隆到表达载入PGEX-4T-1中。将重组质粒转化到表达宿主菌,经终浓度为1mmol/L的IPTG诱导,高效表达了σ3蛋白,融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的25%。经Western-blot检测表明,表达的融合蛋白能够被ARV的阳性血清所识别,具有良好的抗原性。 利用表达的融合蛋白作为抗原,建立了检测ARV抗体的间接ELISA方法,并对ELISA的反应条件进行了探索,确定了抗原的最适包被浓度为3.98μg/ml,检测血清稀释液为200倍稀释,血清与抗原反应最佳反应时间为1.5小时,酶标二抗最佳作用时间为1小时,底物的最佳显色时间为25分钟。采用已确立的ELISA反应条件,检测26份SPF鸡的阴性血清,依据
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