青枯菌噬菌体的分离鉴定及生物学特性分析

来源 :华南农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:tony_yang123
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茄科劳尔氏细菌Ralstonia solanacearum(俗称青枯菌)是世界性重要植物病原细菌,寄主范围广泛,种群复杂。由青枯菌引起的植物青枯病是生产上重要的细菌病害之一,在热带和亚热带地区危害尤为严重。作物青枯病的防治一直是生产上的一大难题,迄今仍未有效的防治药剂,寻求青枯病防治的新途径具有重要意义。噬菌体作为细菌的天然杀手,对宿主菌具有高度的特异性,已被运用于食品,水产及医疗领域,但在植物细菌性病害防治方面,应用较少。本论文从田间的茄科作物根围采集土壤,采用双层平板分离法,获得了15个青枯菌烈性噬菌体,通过对63个青枯菌的侵染试验,可以把15个噬菌体分为2大类,分别为番茄和辣椒宿主青枯菌噬菌体,侵染茄子青枯菌噬菌体,显示出噬菌体与宿主菌之间的相关性。基于15个噬菌体对63个青枯菌菌株进行多样性分析,结果表明,63个青枯菌菌株可分为10个噬菌体型,其中分离自茄子上的青枯菌单独归为1个噬菌体型,其他噬菌体型的青枯菌都分离自不同的寄主植物,显示出青枯菌的遗传多样性。选择代表性的6株噬菌体进行生物学特性测定,结果表明:噬菌体PPep1501-1、PPep1501-2、PE1507-1-S、PE1507-3-S、PTm1555-1和PTm1555-2-L的最佳感染复数分别为1×10-3、1×100、1×10-2、1×10-3、1×10-2、1×102;对应的效价分别为3.44×108、5.10×108、1.12×109、4.93×108、5.73×108、4.70×108 Pfu/mL;在3540℃温度下,pH 59范围内,噬菌体活性仍然较高,但在60℃温度下,活性丧失。6个噬菌体对紫外线、氯仿和乙醚的敏感性存在差异,且影响青枯菌生物膜的形成和细菌的流动性。对噬菌体PPep1501-1、PE1507-3-S和PTm1555-2-L的一步生长曲线测定结果表明,它们的潜伏期分别为20 min、20 min和60 min;裂解期分别约为200 min、200 min和220 min,爆发量分别为122、69、3,显示出不同噬菌体的差异性。噬菌体PTm1555-2-L电镜下显示,其头部呈二十面体,直径约为60 nm,属于尾噬菌体目,长尾噬菌体科。SDS-PAGE电泳结果表明,噬菌体PTm1555-2-L至少有7条蛋白条带,推测其衣壳蛋白分子量为44.4 KD。进一步对噬菌体PTm1555-2-L进行基因组测序,并将测序结果同病毒库database进行blast,筛选到23个scaffold,总共长度为43344bp,GC含量为61.5%,其中17个scaffold分别与青枯菌噬菌体RSK1 DNA、伯克氏菌噬菌体DC1、Bcep22或BcepIL02等基因组的部分序列具有7394%的同源性。基因功能预测结果表明,PTm1555-2-L噬菌体基因组序列中共有42个编码基因,其中50%的基因编码为假定蛋白(hypothetical protein),其它基因分别编码噬菌体蛋白(Phage protein)、噬菌体相关归巢内切酶(Phage-associated homing endonuclease)、噬菌体末端酶小亚基(Phage terminase small subunit)、假定半胱氨酸(putative CysH);3’-磷酸腺苷5’-磷酸硫酸基转移酶(3’-phosphoadenosine5’-phosphosulfate sulfo transferase)、DNA聚合酶III beta亚基(DNA polymeraseIII beta subunit(EC2.7.7.7))和噬菌体抗阻碍蛋白(Phage antirepressor protein),表明,PTm1555-2-L是一个功能及作用机制未知的噬菌体,有待于进一步研究。
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