慢性应激会引起机体过度的心理和生理反应,影响生活质量和身心健康。多项研究结果表明,慢性应激会导致大脑海马、杏仁核和前额叶皮层的神经元数目减少和功能减弱,对认知功能、情绪调节和自主行为造成严重损伤,且这些损伤在老年或患病个体中更为明显。神经元限制性沉默因子(neuron-restrictive silencer factor,NRSF;又称RE-1silencing transcription factor,REST)是神经系统中一种重要的负性转录调控因子,广泛参与神经元的生长分化、轴突生长、囊泡转运和释放以及离子传导,具有在细胞分化、神经再生、神经保护和认知功能等多方面调节神经功能的作用。研究表明,REST在认知功能正常老年人的神经元中高度表达,并随着年龄的增长而增加。近年来研究发现REST在不同神经系统疾病中,扮演不同的角色,尤其在衰老和阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease,AD)中具有重要地位。临床尸检数据表明,海马组织中的REST蛋白与学习记忆具有明显的正相关。REST蛋白表达的减少与阿尔兹海默病病理变化密切相关,由此提示REST可能是改善认知功能的潜在治疗靶点。此外,REST除了对神经系统具有调节作用,还对多种应激刺激具有保护作用,如REST能通过抗氧化应激维持神经元活力。REST直接调节促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin releasing hormone,CRH)表达以及调节11β-羟化酶(11β-hydroxylase deficiency,CYP11B1)进而调控皮质酮的生成从而改善应激所致的损伤。在衰老过程中,下丘脑-垂体-肾上腺轴(The hypothalamic pituitary adrenal axis,HPA axis)系统的负反馈敏感性降低,糖皮质激素受体(glucocorticoid reccptor,GR)的异常,使得皮质酮的来源增加且代谢减少,将会导致机体皮质酮的异常累积,如果针对应激所引起皮质酮的分泌过多不能快速的代谢,将会引起认知功能障碍。在衰老的状态下,AD患者及动物模型中尚未见到REST与疾病相关的报道。机体能否通过REST快速调节HPA轴紊乱所导致的学习记忆损伤值得进一步深究。六味地黄汤(Liuwei Dihuang Decoction,LW)是传统的补益中药的代表。从LW中以活性成分为导向,追踪分离并组成了质量可控且安全性高的六味地黄苷糖(LW-AFC)。本室前期研究表明LW-AFC具有改善AD动物模型认知功能的作用,且LW-AFC可恢复HPA轴紊乱,对急性多重应激和单一因素应激所致的学习记忆损伤也均具有明显的改善作用。上述研究提示LW-AFC具有改善应激所致认知功能障碍。然而,LW-AFC对慢性应激所致的学习记忆损伤的改善作用机制目前尚不明确。REST可通过调节HPA轴,调节N-甲基-D-天冬氨酸受体(Nmethyl-D-aspartic acid receptor,NMDAR)进而改善突触可塑性等多途径改善应激所致的认知功能障碍。LW-AFC是否可通过调节REST进而缓解应激所致的学习记忆的损伤有待探索。本研究首先观察REST在健康老年人、MCI病人和AD患者血清中的表达情况,然后应用人诱导性多能干细胞(Induced Pluripotent Stem Cells,IPSC)观察REST的表达情况。随后应用快速老化小鼠(Senescence accelerated mouse,SAM)这一快速老化动物模型,观察REST在SAM衰老过程中的动态表达情况,然后通过慢性温和应激(chronic mild stress,CMS)模拟各种环境因素和心理应激条件下的应激刺激,观察慢性应激对SAMP8学习记忆及REST表达的影响;最后,观察LW-AFC对慢性应激所致学习记忆损伤的改善作用及其作用机制。一、REST在人外周血样本和人IPSC的表达情况1.REST在认知正常老年人、轻度认知功能障碍(Mild cognitive impairment,MCI)病人和AD患者外周血中的表达情况采用ELISA检测认知正常老年人、轻度认知功能障碍(MCI)和阿尔兹海默病(AD)病人血清中REST的含量,结果未观察到三者血清中的REST含量存在显著差异。相关性分析结果表明,血清中REST的表达与简易精神状态检查表(Mini-mental state examination,MMSE)量化评分无明显相关性。2.人源IPSC及其诱导分化的神经细胞中REST的表达情况应用认知正常年轻人、正常老年人和AD病人来源的IPSC,将其诱导分化为神经干细胞、小胶质细胞和神经元。采用免疫蛋白印迹技术(Western Blot,WB)技术检测REST的表达情况。结果显示,认知正常老年人IPSC中REST的蛋白表达显著高于年轻人,AD患者IPSC中REST的蛋白表达显著低于认知正常老年人。而在年轻人、认知正常老年人和AD病人IPSC诱导分化的神经干细胞、神经元及小胶质细胞中未观察到REST蛋白表达在不同来源中的差异。二、慢性温和应激对快速老化小鼠学习记忆及REST表达的影响1.快速老化小鼠衰老过程中REST的动态表达情况选取2、6、12月龄的快速老化小鼠(Senescence Accelerated Mouse P8,SAMP8),以同月龄抗快速老化亚系(Senescence Accelerated Mouse Resistant 1,SAMR1)小鼠作为对照。采用WB检测SAMR1和SAMP8衰老过程中海马组织中的REST表达情况。结果表明,在2月龄SAMR1海马中REST的表达最高,但2、6以及12月龄之间未见明显的差异。在2月龄SAMP8海马中REST的表达最低,在6月龄和12月龄SAMP8海马中REST的表达逐渐升高,12月龄相较于2月龄有显著性升高,但12月龄与6月龄无显著性差异。与同月龄SAMR1比较,6月龄SAMP8小鼠海马组织中REST的表达显著性增加。2.慢性温和应激对快速老化小鼠学习记忆及REST表达的影响以SAMR1作为对照,选取8月龄雄性SAMP8,慢性温和应激28天后,检测其筑巢能力;应激28天后应用新异物体识别实验及长时程增强(Long-term potentiation,LTP)实验,观察CMS对小鼠学习记忆能力的影响。结果表明,SAMP8给与应激后可改善其筑巢能力;相较于模型组,应激组物体识别能力显著改善,且LTP增强。采用ELISA测定应激28天后小鼠血浆皮质酮水平,WB检测小鼠海马REST蛋白、脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)以及NMDAR的亚基NMDAR2A/2B蛋白的含量,观察CMS对SAMP8脑中REST-NMDAR轴的影响。应激组的皮质酮含量相较于模型组升高。此外,SAMR1应激组与SAMR1对照组比较,CYP11B1表达显著性降低。NMDAR1、REST以及BDNF在SAMP8应激组较SAMP8对照组出现显著性增加;CYP11B1出现显著性降低。该结果表明,适度应激可改善老化小鼠学习记忆能力。适度应激改善SAMP8学习记忆可能与NMDAR1、REST以及BDNF含量增加有关。三、LW-AFC改善慢性应激所致学习记忆损伤的作用及其机制研究采用8周龄Balb/c,给与慢性应激。应激7天后,应激组相较于对照组,筑巢能力显著性降低,海马组织中NMDAR2A及BDNF蛋白表达升高;显著性升高血清皮质酮,给予LW-AFC后能够显著改善应激后所致的筑巢能力损伤。应激14天后,应激组相较于对照组,筑巢能力降低,显著性升高血清皮质酮,升高海马组织中NMDAR2A/2B及BDNF蛋白表达;给与LW-AFC后,相较于应激组,NMDAR2A/2B蛋白表达升高;显著性升高REST含量。应激21天后,应激组相较于对照组,显著性升高血清皮质酮,物体识别能力中的1小时辨识指数降低,LTP显著性降低,给与LW-AFC后,相较于应激组,具有明显的提高LTP作用,NMDAR2A、REST以及BDNF蛋白的表达升高。应激28天后,应激组相较于对照组,筑巢能力显著性降低,显著性升高血清皮质酮,1小时辨识指数显著性降低,LTP显著性降低,给与LW-AFC后,相较于应激组,血清皮质酮显著性降低,1小时辨识指数显著性增加,具有明显的提高LTP作用,NMDAR2A及REST含量升高。其中REST含量显著性升高。应激35天后,应激组相较于对照组,筑巢能力显著性降低,1小时辨识指数降低,但未见显著性差异,24小时的辨识指数显著性降低,LTP极显著性降低,给与LW-AFC后,相较于应激组,筑巢能力显著性增加,1小时辨识指数和24小时辨识指数均显著性增加,具有显著的提高LTP作用。通过以上研究,本研究主要得出以下结论:(1)老年人、MCI和AD患者血清中的REST蛋白含量无显著性差异;年轻人、认知正常老年人和AD患者源的IPSC中,REST在在认知正常老年人IPSC中表达最高,AD患者源的IPSC中的REST表达显著低于认知正常老年人。但在IPSC诱导分化形成的NSC、神经元以及小胶质细胞中未观察到REST表达的差异。(2)在快速老化小鼠SAMP8海马中,REST蛋白表达量随月龄的增加而增加,其中2月龄SAMP8含量最低,12月龄SAMP8含量最高。8月龄的SAMP8小鼠给与适度慢性应激可改善小鼠学习记忆能力,其作用机制可能与升高REST含量来增加NMDAR2A向2B的转换,同时抑制皮质酮的生成有关。(3)LW-AFC可以改善慢性应激4周所致学习记忆损伤,其作用机制可能与改善HPA轴紊乱,升高REST含量,调节NMDAR2A/2B的平衡有关,提示LWAFC可能通过影响REST信号通路发挥了抗应激作用,LW-AFC有望发展成为抗应激药物。