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神经坏死症病毒(nervous necrosis virus，NNV)是最具破坏性的海水鱼类病原之一，对苗种生产期的仔鱼和幼鱼危害很大，会引起鱼类中枢神经组织脑和视网膜细胞空泡化，严重者可导致一周内鱼苗死亡率高达100％。至今已报道的受该病原危害的鱼类包括鳗鲡目、鲈形目、鲽形目、纯形目、鳕形目中的50余种鱼。在中国和东南亚国家，赤点石斑鱼神经坏死症病毒(red-spotted grouper nervous necrosis virus，RGNNV)是大多数海水鱼类病毒性疾病的主要流行病原。在RGNNV感染早期，快速准确检测出感染的病原，进而采取有效的防控措施，对于控制病毒的大规模爆发流行极为重要。但是目前针对RGNNV的防控措施还非常有限，因此，研究和发展针对RGNNV检测诊断技术和治疗方法迫在眉睫。核酸适配体具有高度特异性和亲和力、高稳定性、无毒性和易合成性等诸多优点，在疾病诊断和治疗方面具有很好的应用前景，但其在海洋鱼类病原防控中的应用研究还很欠缺。本研究运用指数富集的配基系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)，筛选和鉴定了一系列针对RGNNV衣壳蛋白(coat protein，CP)和病毒感染细胞的特异性核酸适配体，并将其应用于RGNNV检测和抗病毒研究，取得了如下研究结果: 1.以RGNNV病毒粒子唯一的结构蛋白衣壳蛋白(CP)为靶标，运用SELEX技术筛选并鉴定出高特异性识别CP蛋白的核酸适配体（A5、A10和B11）。二级结构和最小自由能(△G)预测表明，这些核酸适配体可以形成稳定的茎环结构。EMSA、ELASA、Kd测量及流式细胞术分析结果证实，这些核酸适配体特异性结合CP蛋白，亲和力达到纳摩尔级别。同时，竞争性结合实验结果表明核酸适配体与抗CP抗体竞争性结合部分的CP结合位点。此外，在体外和体内实验中，三种核酸适配体均未显示出明显的毒性作用，并可抑制RGNNV感染。四甲基罗丹明(TAMRA)标记的核酸适配体能够用于指示RGNNV病毒粒子侵染宿主细胞的动态过程。 2.利用特异性结合CP蛋白的核酸适配体A10，开发了用于RGNNV精确快速诊断的夹心核酸适配体吸附检测技术(enzyme-linked apta-sorbent assay，ELASA)。研究结果表明，建立的ELASA能够特异性检测病毒感染的细胞和组织中的RGNNV衣壳蛋白(CP)和病毒粒子。该方法灵敏度高，当病毒感染的细胞数目低至4×103时，孵育时间短至10min，ELASA均可检测到RGNNV感染。稳定性分析结果显示，工作温度高达37℃时仍然可以区分RGNNV感染的样品与阴性对照。对石斑鱼脑组织样品的ELASA检测结果与逆转录PCR的一致，只是灵敏度降低10％。这种夹心法ELASA可以在石斑鱼养殖过程中快速检测RGNNV的感染，具有操作简便快捷、稳定性强、灵敏度高等优点。 3.将核酸适配体B11进行截短优化。ELASA和流式细胞仪分析结果显示，截短后的核酸适配体B11s仍然可以特异性结合CP和RGNNV病毒粒子。基于结构优化后的核酸适配体B11s构建特异性运载siRNA的靶向药物载体，发现核酸aptamer-siRNA复合物对RGNNV感染有抑制作用。毒性测试表明，该特异性运载系统在工作浓度无细胞毒性。 4.以RGNNV感染细胞为靶标，运用Cell-SELEX成功筛选并鉴定出能特异性识别和结合病毒感染细胞的核酸适配体GBN2、GBN10和GBN34，解离常数Kd值分别为27.96、29.3和59.5nM，且均可以形成稳定的茎环结构。这些核酸适配体不仅可以特异性识别和结合体外感染的脑细胞，还能够识别和结合病毒感染的鱼体脑组织。进一步的研究表明，核酸适配体在细胞水平和活体水平均具有较强的抗病毒活性，且无毒性。此外，荧光显微镜和流式细胞分析结果表明，核酸适配体GBN34可以在4h内以恒定速率特异性地内吞进入RGNNV感染细胞内部。 本文优化了蛋白-SELEX和Cell-SELEX筛选技术体系，分别成功筛选获得了针对RGNNV病毒CP蛋白和病毒感染细胞的核酸适配体。筛选到的核酸适配体能特异性识别与结合病毒和病毒蛋白、或病毒感染的细胞，具有抗病毒活性，且无明显毒性。基于核酸适配体发展的夹心法ELASA用于RGNNV检测，具有便捷、耗时短、灵敏度高的特点。获得的这些核酸适配体可以用作分子探针来示踪病毒侵染的动态过程，研究病毒感染的分子机制，并且具有发展成为靶向药物载体或抗病毒药物的潜力。