树突状细胞(Dendritic cells，DC是目前所知功能最强的抗原呈递细胞(Antigen presenting cells，APC)，在机体的抗肿瘤免疫中具有重要作用。基于DC的肿瘤疫苗成为肿瘤免疫学研究的热点。DC疫苗的构建方法包括DC体外扩增后回输，细胞因子基因修饰DC，抗原基因转染DC，肿瘤细胞mRNA冲击DC、肿瘤抗原多肽冲击DC、肿瘤细胞裂解物冲击DC、肿瘤细胞与DC融合等。其中肿瘤细胞与DC融合更具优势，较为理想。白细胞介素(Interleukin，IL)-12、IL-7、IL-18、粒-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)等细胞因子具有较强的免疫促进作用，与DC疫苗联用有望提高DC疫苗的免疫效力，其中IL-18为多效性细胞因子，具有显著的抗肿瘤作用，将IL-18基因修饰与DC疫苗相结合可能会增强DC疫苗的免疫效应。 为探索更为高效的DC瘤苗，本实验将肿瘤抗原、DC的抗原呈递功能和细胞因子IL-18的免疫刺激活性相结合，构建含IL-12 P40信号肽序列的IL-18融合基因，以其转染NCI-H460肺癌细胞株，将此转基因细胞与DC融合，刺激活化T细胞，研究其在体外及动物体内的抗肿瘤作用，并与未转染融合细胞及NCI-H460细胞裂解物冲击DC诱导的T细胞的作用比较，以明确IL-18修饰的DC融合疫苗诱导的免疫作用是否优于后二者。 本实验分为五部分： 第一部分 DC的诱导培养和鉴定 分离外周血单个核细胞(Peripheral blood monoeuclear cell，PBMC)，经贴壁获得单核细胞，用含GM-CSF和IL-4的培养液恒温培养，第5天起加肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)α100ng/mL刺激DC成熟，倒置显微镜下观察细胞形态；第8天取DC行电镜扫描鉴定形态； 浙江大学 博士学位论文用流式细胞仪检测DC表面CD14、CDla、CD54、CD83、CD86和HLA－DR的表达；用CD3磁珠筛选T细胞，用四甲基偶氮哩蓝（MTT）法测定DC对T细胞增殖的影响，以鉴定DC的功能。结果培养第8天倒置显微镜下细胞表面具有大量突起和毛刺，扫描电镜示DC呈棘状，符合＊C的形态：＊D14低表达，＊Dla、＊＊54、＊＊83、＊D86和＊＊A．＊R高表达；能明显刺激T细胞增殖。经过形态、表型和功能鉴定，成功诱导了具有功能的成熟DC。第二部分分泌型人 IL－18重组质粒的构建 用Triz。l一步法自LPS刺激的人PBMC中抽提总RNA，逆转录－聚合酶链反应（reversetranscrlPtase Polymerase chain re。non，RT－PCR）分别扩增巳－12P40的信号肽序列和 IL．18的成熟肽序列，用重叠延伸法拼接扩增含前二者的融合片段：将其连接于帅＊＊－T克隆载体，转化JM109菌株，挑取阳性克隆扩增后，提取质粒，酶切鉴定，取含融合基因片段的菌液，测序鉴定；取序列正确的质粒，酶切质粒及pCDNA3．广表达载体，二者连接后转化JM109菌株，挑取阳性克隆，提取质粒，取酶切鉴定含融合基因片段的菌液，行序列测定，将序列正确的克隆扩增、冻存。结果经RT－PCR扩增的片段与u－12P40信号肽序列和JL－18的成熟肽序列的预计长度相符合；重组克隆质粒和重组表达质粒的酶切片段符合预计结果；序列测定结果与设计完全符合。表明成功构建了含 IL－12 P40信号肽序列的 IL－18融合基因的重组质粒。第三部分分泌型人 ILIS的真核表达 常规培养NCIH460细胞，取对数生长期细胞，用脂质体转染上述重组质粒及pCDNA3．l＋空载体，经 G4筛选，用无菌移液枪在倒置显微镜下吸取克隆，经 3－4周筛选培养后，行 RT－PCR检测融合基因 mRNA表达，并检测空载体转染细胞 G4抗性基因 mRNA的表达，取细胞培养上清液，浓缩并过滤后行 Western blot分析转染细胞 ILIS蛋白的表达，用 MTT法测定转染细胞培养上清对 T细胞增殖的影响，以判断所表达的 IL－18有无生物学功能。结果 RT－PCR示基因转染细胞有融合基因表达，而转染空载体细胞及未转染细胞均无表达：Western Blot示基因转染细胞上清中有 18Kda的蛋白表达；基因转染细胞明显刺激 T细胞增殖。经 G4筛选、mRNA测定、蛋白表达检测及所表达蛋白的功能测定，表明 NCIH460细胞成功转染了 IL－18融合基因并稳定表达了具有生物学功能的成熟 IL－18。第四部分 DC与 ILIS修饰的 NCI．H460细胞融合 DC的诱导培养同第一部分。NCIH460细胞及融合基因转染细胞常规培养，按DC与前H者比例 2＊分别用聚乙＝醇（polyethylene glycol，PEG）法将 DC与 NCI－H460细胞及融合基因 3 浙江大学 博士学位论文转染细胞融合，用异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiacyanate，FITC）标记的cD83抗体标记融合细胞后，经抗FITC磁珠筛选，用流式细胞仪检测融合细胞藻红蛋白（Phycoerythrin，PE）标记的CD86的表达，用MTT法测定两种融合细胞对T细胞增殖的影响，以NCIH460细胞为对照。结果经磁珠筛选，融合细胞CD86表达率为（95．97土4