白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor，LIF)，能够抑制白血病细胞，如HL-60、U937、M1等的增殖。然而，白血病细胞的增长快速并且对LIF的感应能力差的特性，使得机体内有限的LIF无法抑制白血病细胞的恶性增殖。而外援性、非生理剂量的LIF对脂肪细胞、生殖细胞和内分泌细胞等正常细胞有细胞毒性，同时干扰了细胞因子间的正常协调作用，所以LIF的药用价值也不能得到体现。 LIF是一种多功能，作用广泛的细胞因子。它的生物学效应是通过结合靶细胞膜上的LIF受体(LIFR)完成的，LIFR包括两个亚基：LIFRα(gp190)和LIFRβ(gp130)，其中，LIFRβ是一个分子量130KD的糖蛋白，是一个共用亚基，又称IL-6信号转导子，是研究较为清楚的一个亚基。LIFRα是一个分子量190KD的糖蛋白，共有1239个氨基酸，其中胞外区由789个氨基酸组成，跨膜区由26个疏水氨基酸(Leu、Val、Ile、Ala、Gly)组成，胞内区有238个氨基酸，没有激酶活性和GTP结合位点，但有功能域，即蛋白激酶作用点和活性蛋白结合点，LIFRα的胞内区共有3个结构域(Box1、Box2、Box3)，这一官能体的结构为YXXQ(Y为酪氨酸，X为任意氨基酸，Q为谷氨酰胺)，是激活细胞内信号分子的必须序列。在LIF-LIFR的信号通路中，LIF首先与LIFRα结合，并使之与另一受体亚基β亚基结合形成异源性二聚体，从而启动细胞内信号转导使胞外的信号传入核内，调控特定基因的表达，使细胞产生一系列的生理和病理变化。 研究LIF的胞内信号转导对了解LIF发挥生物学功能的分子机制有重要意义。在LIF抑制白血病细胞增殖的过程中，JAK-STATS通路是LIF产生活性的重要途径，而在众多的STATS中Stat3的激活与白血病细胞的分化关系最为密切，有关LIF与有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)P44／42的关系，在1994年被Schiemann证实。然而，LIFR两个亚基在启动JAK-STATS途径以及P44／42 MAPK的第二军医大学硕士论文中文摘要激活，进而抑制白血病细胞增殖中各自有何作用?对这一问题，学者们观点不一。起初，人们简单的以为gp 1 90亚基的主要作用是结合gP130从而与LIF一起形成信号转导复合体，而gP130亚基则主要起传递信号的作用。然而，即190的胞内区也含有3个结构域，它的胞内区并不象某些只起受体聚合效应的受体亚基的胞内区那么简单，那么短。近几年，一些学者对该受体a亚基细胞内区的信号启动功能域进行了深入研究。Henn~s证实LIF受体a亚基细胞内区近膜段与stat3结合，远膜段激活Stat3。Tomida更进一步研究发现LIF受体a亚基即190远膜段的第三个YXXQ功能体(Box3)是stat3磷酸化的必需结构。 在我们以往的研究中发现，高表达的LIFRa亚基在无须LIF的诱导下便可使白血病Stat3激活。为此，我们按LIFRa亚基细胞内区第三个功能域(Box3)设计一种小分子一一1 90CT3，并使其在白血病细胞内表达，通过检测其下游信号分子Stat3及P44/4 2 MA卫K磷酸化水平，研究其是否具有LIF受体的信号启动效应从而抑制白血病细胞的生长。从而克服白血病细胞对LIF不敏感的不足，进而研制成为对白血病细胞有较特异杀伤作用的新的生物药物。 本研究首先成功筛选并建立了两种白血病(IIL一60)细胞株即PcDNA3 .0一1 90CT3重组子白血病细胞株、PcDNA3 .0空载体白血病细胞株，利用细胞计数、免疫组化、免疫沉淀、蛋白印迹、流式细胞仪等生物学实验方法，从形态学、蛋白表达量、磷酸化水平等方面分析细胞形态变化、细胞增殖核杭原(PCNA)和CD15在三种细胞株中的表达情况及Stat3、P44/42 MAPK磷酸化水平，进而分析190CT3是否可以替代UF启动下游的信号转导，进而抑制白血病细胞的增殖并促进其分化;另一方面我们通过不同细胞株注射的裸鼠各器官的增生及淋巴细胞侵润情况的比较，分析不同细胞株的恶性程度，进而分析在动物体内1 90CT3是否有抑制白血病细胞增殖的作用。 结果发现:l)构建190CT3 cDNA表达载体:藉BamHI和xbal位点将目的片段重组于真核表达载体peDNA3 .0中。然后转化入DH5a中，涂平板、挑克隆，用B印nHI和Xbal酶切鉴定，证第二军医大学硕士论文中文摘要实重组质粒中含有预期大小的片段(375饰)，挑选含有插入片段的重组子peDNA3 .0一1 90cT3。挑选含有插入片段的克隆进行测序，序列为375bp，且无碱基突变。2)通过脂质体转染，将空载体和重组子分别导入处于对数生长期的HL一60细胞，G418筛选(G418600雌/ml)，挑选G418阳性克隆。成功构建了两种细胞株:PcDNA3 .0一1 90CT3重组子HL一60细胞株、PcDNA3 .0空载体HL一60细胞株;3)免疫组织化学法检测190CT3表达发现，PcDNA3.0-190CT3重组子HL一60细胞株中19OCT3表达的阳性强度明显高于PcDNA3 .0空载体HL一60细胞株和HL一60细胞，而后两种细胞的阳性强度无明显差别;3)细胞形态观察和生长比较发现，peDNA3 .0-190CT3重组子I王L一60细胞株与其他两种细胞相比，细胞形态变的不规则，有伪足伸出，细胞体积变大，细胞增殖明显减缓;4)Westem blot检测pCNA水平发现，pcDNA3 .0一19oCT3重组子HL-60细胞株PCNA的表达水平明显低于其他两组;4)流式细胞仪检测CD 15发现，pcDNA3 .