论文部分内容阅读
产肠毒素性大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC)是全球性人和动物传染性腹泻的重要病原体之一，给畜牧业造成巨大的经济损失，同时给人类公共卫生安全造成重要威胁。本研究利用PCR和基因重组等技术，克隆了产肠毒素性大肠杆菌STa和K99基因，并将其融合构建了穿梭质粒，将穿梭质粒和骨架质粒在293细胞内进行包装得到重组腺病毒。PCR鉴定结果表明，成功构建了重组腺病毒载体Ad5 STaK99，在此基础上，利用Western blot方法对重组腺病毒进行了融合蛋白表达的检测及免疫原性研究，为研制预防由ETEC引起的新生动物腹泻重组腺病毒载体疫苗奠定基础。主要实验结果如下：
1.根据设计的特异引物，利用PCR技术，成功克隆了STa基因和K99基因，核苷酸序列测定结果有一个碱基突变，导致一个氨基酸的突变，分析表明，两氨基酸性质相同，蛋白质三级结构预测一致，不影响蛋白的免疫原性。
2.将克隆的STa、K99基因通过T4连接酶与穿梭质粒pAd5CMVK-NpA连接，成功构建了穿梭质粒pAd5 STa-K99。将穿梭质粒pAd5 STa-K99和骨架质粒经PacⅠ分别进行酶切后回收，在293细胞内进行包装，细胞出现明显的病变效应，表明成功获得了重组腺病毒。
3.将获得的重组腺病毒在293细胞内大量扩增，通过CsCl密度梯度离心法进行了纯化，根据ST-K99融合基因特异引物进行PCR反应，出现了预期大小的条带，表明STa-K99融合基因整合至腺病毒载体，成功构建重组腺病毒Ad5 STa-K99。将重组腺病毒Ad5 STa-K99感染的细胞提取蛋白，利用K99特异血清抗体对其表达蛋白进行了Western Blotting检测，结果显示，在约22kD处出现特异性条带，表明重组腺病毒Ad5 STa-K99在细胞内成功表达融合蛋白，且融合蛋白可以被特异性抗体识别。