构建应用于DNA和多核苷酸激酶检测的DNA纸基传感器

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滤纸是一种生物兼容性好、检测背景低、试样消耗量低、来源丰富的材料,常用作便携式分析器件的基底。纸基分析器件如纸基微流控芯片、侧向层析纸条等在检测蛋白质、葡萄糖、核酸、病原体等多种对象时显示出优良的性能,逐渐成为即时检测(point-of-care testing,POCT)领域最具潜力的发展方向。开展DNA的纸基检测一方面为发展DNA的即时检测器件提供了理论基础,另一方面可利用DNA纸基传感器实现对蛋白质、酶等其它生物大分子的研究。  激酶是一类催化从高能供体分子中转移磷酸根基团至特定底物(蛋白质、核苷酸)的酶,大量的细胞活动过程均涉及到磷酸化反应,研究表明,DNA磷酸化过程障碍能够引起某些严重的染色体疾病,因此,激酶在生命过程中起到重要的作用,开展激酶活性的检测对于生物医学研究有重大意义。传统的激酶活性检测方法存在检测周期长、成本高、操作复杂等不足,纸基平台为激酶检测提供了灵敏、高效的新方法。  在第二章中,基于纸平台发展了ssDNA检测的荧光分析方法,对纸基的前处理方法以及前处理条件进行了优化,在此基础上考察了DNA探针固定效率与其浓度的关系,在DNA探针固定效率最高的条件下对目标单链的检测情况进行了考察,其检测的线性范围达到5个数量级。以荧光染料修饰的ssDNA为探针,构建“三明治”状的三链荧光猝灭体系,优化了实验条件以提高体系的荧光猝灭效率,最大猝灭效率超过了50%,在此基础上对ssDNA的检测情况(线性范围,检出限)进行了考察。  在第三章中,基于纸平台开展了多核苷酸激酶活性检测的荧光分析方法,首先基于前面的工作构建了荧光猝灭效率最高的荧光猝灭体系,优化了多核苷酸激酶催化的磷酸化过程与外切酶催化的双链断裂反应的反应条件,在最优条件下考察了激酶检测的线性范围,该体系对多核苷酸激酶的检出限低至0.0001UmL-1。与现有的激酶检测方法相比,该方法具有检出限低,成本低,操作简单的优点。
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