CD8+T细胞是机体清除病毒感染和肿瘤的主要效应细胞,其杀伤能力与多种指标密切相关。其中,功能亲和力,也称抗原敏感度,综合反映了T细胞从抗原识别到执行效应功能的能力,是评价细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocyte, CTL)效应的重要指标之一。顾名思义,高功能亲和力的T细胞对抗原刺激比较敏感,可以在抗原浓度较低的情况对其进行识别,并启动免疫应答以杀伤靶细胞。这种具有快速杀伤活性的细胞对病原体感染的早期清除至关重要。因此,近年来,功能亲和力往往作为评价疫苗效果的免疫指标被广泛认知。其评价方法为,用梯度稀释的多肽体外刺激疫苗诱导的免疫细胞,量化不同浓度多肽刺激所诱导T细胞的效应功能,如分泌细胞因子的能力、裂解靶细胞的能力等,以达到最大效应功能50%所需要的肽浓度作为衡量标准。值得注意的是,尽管有报道证明单个T细胞可以经过不同方式的体外刺激诱导分化为功能亲和力高低不同的细胞,其机制也已经被阐明。但是,如何通过疫苗在体内诱导高功能亲和力的T细胞以及其中相关的调控机制,还不清楚。本课题以此为切入点,对痘病毒疫苗诱导功能亲和力成熟的调节通路进行了相关的描述性研究和机制探索。我们的前期研究发现,与DNA疫苗单独重复免疫相比,DNA疫苗初免-痘病毒加强的免疫方案可以诱导功能亲和力较强的抗原特异性CD8+T细胞。本课题对此现象进行了重复验证,并利用不同肽段刺激(优势单肽、亚优势单肽以及全肽库)、不同免疫原以及不同基因背景的小鼠模型确证了该现象。然后,我们对相关调控机制进行了探索性研究。首先,我们评价了相关文献提示的可能与功能亲和力相关的一些经典T细胞检测指标,如辅助性T细胞分泌细胞因子的情况、抗原特异性CD8+T细胞的多功能性以及记忆分群情况等。数据显示,在我们的体系中,痘苗诱导的高功能亲和力与这些指标无明显相关性,提示功能亲和力的体内调节不受这些已知的信号通路调控。然后,因为功能亲和力的检测体系往往是通过体外刺激脾细胞进行的,并没有区分T细胞和抗原提呈细胞(Antigen Presenting Cells, APC)等,而本文所用的痘病毒载体可于免疫后在体内存活一段时间,所以,T细胞功能亲和力的升高可能是痘病毒诱导的APC抗原提呈效率升高的结果,也可能是T细胞激活能力增强的原因。为了验证这一点,我们将DNA免疫组和痘病毒免疫组的CD8+T细胞分别分选出来,与相同来源的APC (Naive小鼠或痘病毒载体免疫过的小鼠)共孵育,或者将各组的CD8+细胞和CD8-细胞分别纯化后进行组间混合,然后进行功能亲和力的检测。结果发现,这样处理后,两个免疫组的功能亲和力无明显变化,且顺序保持一致,从而排除了自体APC抗原提呈能力的影响,并证明了痘病毒疫苗加强所诱导功能亲和力的提高主要在CD8+T细胞亚群上。另外,提示功能亲和力的调节机制与T细胞激活能力有关。随后,我们从T细胞激活信号通路的角度对痘苗免疫调控功能亲和力的机制进行了探索性研究。作为T细胞激活的第一步,肽-主要组织相容性复合物(peptide-Major Histocompatibility Complex, pMHC)和T细胞受体(T Cell Receptor, TCR)的相互作用是功能亲和力的决定因素之一。pMHC复合物形成后,可以通过优先选择与之结合力较强的TCR,从而更好的诱导T细胞应答以提高功能亲和力。为了在疫苗体系中验证TCR选择与功能亲和力的的关系,我们使用了TCR转基因OT-Ⅰ小鼠,该小鼠仅存在一种T细胞受体且只能识别模式抗原卵清蛋白(Ovalbumin, OVA)的一部分肽段。具体的,我们分选出OT-Ⅰ的CD8+T细胞并将其过继至C57BL/6小鼠中,以OVA作为免疫原对其进行不同方案的免疫,观察仅存在单一TCR的情况下,痘病毒是否依然具有提高抗原特异性CTL功能亲和力的能力。实验结果发现,在此小鼠过继模型中,痘病毒免疫组诱导的功能亲和力仍然高于DNA单独免疫组,从而排除了TCR选择对痘苗诱导功能亲和力调控的影响,并且提示,痘苗对功能亲和力的调控发生在pMHC和TCR结合以后的阶段。继而,作为TCR信号通路上游的接头分子,ZAP-70和Lck的激活是下游信号通路的必经过程,而且已有体外刺激实验和痘病毒感染实验证明了这两个分子在功能亲和力成熟中具有重要作用。因此,我们检测了这两个分子的磷酸化程度,以评估它们在疫苗体内调控功能亲和力中的作用。我们观察到,痘病毒免疫后,抗原特异性CD8+T细胞的ZAP-70本底激活水平显著高于DNA单独免疫组,而在抗原肽刺激后,痘病毒免疫组激活Lck的能力明显更强。因此提示,痘病毒免疫后,抗原特异性CD8+T细胞处在一个更容易被激活的状态,随后的抗原特异性细胞全基因组表达谱芯片分析支持这个推论。因此,这部分的数据提示,痘病毒疫苗加强免疫提高抗原特异性CD8+T功能亲和力的能力与TCR近端分子的激活程度升高引起的T细胞激活阂值降低相关。最后,炎症因子是T细胞激活的第三信号,在我们的免疫体系中,痘病毒可以引发一定水平的炎症因子的分泌。因此,为了验证痘病毒诱导的炎症微环境与功能亲和力调控的关系,我们进行了以下实验。第一步,我们将痘病毒载体和DNA疫苗混合后免疫小鼠,观察痘病毒载体诱导的炎症微环境是否可以提高DNA疫苗的免疫原性,数据显示,DNA疫苗所诱导的抗原特异性T细胞免疫应答并没有因为炎症微环境的加入而升高,提示功能亲和力的调控不受炎症因子分泌的影响；为了验证这一点,我们进行了第二步的实验：由于机体对痘苗的固有免疫应答由树突状细胞(Dendritic Cells, DC)上的髓样分化因子88 (Myeloid Differentiation Primary Response Gene 88, MyD88)介导,因此,我们引入了MyD88转基因缺陷小鼠作为免疫受体鼠,以排除痘病毒载体诱导的固有免疫对重组痘苗免疫原性的影响。有意思的是,数据显示,在该缺陷小鼠免疫模型中,重组痘苗所诱导的抗原特异性免疫应答显著降低,而功能亲和力也不再显著高于DNA单独免疫组,证明MyD88分子的表达在机体对痘苗的免疫应答,特别是功能亲和力的调控中占有至关重要的地位。考虑到CD8细胞上MyD88分子介导的信号通路在痘病毒感染中同样发挥了重要作用,这部分数据提示,重组痘苗提升抗原特异性CTL功能亲和力的能力,可能跟DC上MyD88介导的对痘病毒的固有免疫相关,也可能与CD8细胞上痘病毒激活的MyD88信号通路相关。因此,我们进行了第三步的实验进行验证,即,将OT-Ⅰ的CD8+T细胞过继至MyD88-/-小鼠中并对其进行不同免疫方案的免疫,在此免疫模型中,CD8+为MyD88阳性,功能正常,而DC为MyD88阴性,固有免疫缺陷。数据显示,此模型中,重组痘苗重新恢复了提高功能亲和力的能力,从而确证了,重组痘苗对功能亲和力的调控与痘病毒载体所诱导的炎症微环境无关,并且提示,该过程是由CD8细胞上MyD88分子介导的信号通路所调控的。综上所述,我们的研究结果证明,重组痘苗的加强免疫可以将DNA疫苗初免所诱导的低功能亲和力抗原特异性CD8+T细胞转变为高功能亲和力细胞,该过程的调控与TCR近端分子的激活程度和痘病毒载体感染诱导的CD8细胞上MyD88信号通路相关,与T细胞受体选择和痘病毒诱导的固有免疫无关。本实验为新型疫苗的设计、疫苗免疫方案的优化和T细胞免疫调节剂的寻找提供了科学依据。