协同刺激分子是T淋巴细胞活化过程中一类重要的调节分子。表达于抗原递呈细胞(APCs)和T细胞表面的协同刺激分子对相互作用后,可增强或减弱TCR信号从而调控T细胞的免疫应答。根据协同刺激分子的结构差异其可分为两类:免疫球蛋白超家族与肿瘤坏死因子超家族,而其中B7家族分子是表达于APCs细胞包括树突状细胞、单核细胞、朗格汉斯细胞、巨噬细胞和B细胞表面的协同刺激配体分子,属于免疫球蛋白超家族。协同刺激分子B7-H3是近年来新发现的B7家族的成员之一,是Chapoval等人从人树突状细胞的cDNA库中克隆得出,发现距今仅有十年时间。B7-H3分子与B7家族其它成员不同之处在于小鼠B7-H3分子仅有1种表达形式--2IgB7-H3,该蛋白胞外段拥有一个免疫球蛋白V样结构域和C样结构域;而人B7-H3分子存在2种异构体:一种体外含有4个免疫球蛋白结构域,2个重复并排的VC,命名为4IgB7-H3或B7-H3b;另一异构体胞外段含有一个V和一个C,为2IgB7-H3。4IgB7-H3为人大部分细胞和组织中的主要表达形式,其胞外段两对VC之间碱基重复率为98%,是2IgB7-H3基因复制的结果。最初的研究表明B7-H3能刺激CD4+T细胞的增殖,使CTL活性增加,同时提高IFN-γ的分泌和表达,被认为是一正性协同刺激分子。随后的研究发现,B7-H3信号可负性调控T细胞的活化及其介导的免疫应答,因此认为B7-H3可能是一负性协同刺激分子。该分子生物学功能的争议可能与其受体未知相关,有研究者报道B7-H3可能与TLT-2分子相结合介导正性协同刺激信号,也有研究者否认了此观点。B7-H3分子的生物学功能的不明确除了与受体未知外,也可能与其存在2种异构体相关,不同的异构体结合不同的受体可能发挥不同的生物学功能,如B7.1与B7.2可与2种受体CD28与CTLA-4相结合介导相反的生物学功能。已有的研究表明,多种协同刺激分子能分别以细胞膜型和可溶型两种形式存在,包括CD28、CTLA-4、CD80、CD86、ICOSL、B7-H3和B7-H4等。可溶性分子可以通过蛋白水解酶裂解细胞上的膜型分子而形成,也可由专一的mRNA直接编码产生。本实验室在2008年首次报道可溶性B7-H3(sB7-H3)的存在,其在外周血和脑脊液的表达高低有助于细菌性脑膜炎的诊断,且在非小细胞型肺癌及脓毒血症具有高表达的临床意义。但可溶性B7-H3来源于何种异构体及其来源的机制尚未明确。本研究旨在通过生物信息学的研究方法从各类核酸和蛋白质数据库中调取从硬骨鱼至哺乳动物各物种B7-H3序列,分析基因结构以预测其异构体的表达并通过分子生物学实验验证生物信息学预测结果。继而通过序列的比对分析和进化树的构建推导4IgB7-H3外显子复制的模式以指导生物学功能是否存在差异。在分析各物种B7-H3序列过程时我们发现一段保守性氨基酸,其可成为影响可溶性存在形式的重要序列。蛋白质空间构象模拟和融合蛋白结合实验提示2种异构体可结合不同的受体;继而通过体外实验研究发现人2种异构体对T细胞和单核细胞存在不同的生物学功能。一、B7-H3分子2种异构体在不同物种中的分布及其基因复制模式的研究【目的】探讨B7-H3分子2种异构体在不同物种中的分布,回答如下科学问题:为何小鼠仅存1种形式B7-H3分子,而人存在2种。研究4IgB7-H3外显子复制的模式以辅助研究其与异构体2IgB7-H3是否存在生物学功能差异。【方法】通过生物信息学方法从各类数据库中搜索各物种B7-H3序列,分析结构域的数量及剪切形式预测异构体的分布;获取代表性物种组织抽提RNA,PCR验证预测结果。构建各物种B7-H3的进化树及对种间、种内V区和C区的序列进行聚类分析,计算各物种V1C1和V2C2的dN和dS比。【结果】获取了38个物种的B7-H3序列,其中豚鼠、家犬、非洲象、牛、熊猫、蝙蝠及高级灵长类动物如黑猩猩、大猩猩、猴等物种中存在2种剪切体;RT-PCR方法证实了2种剪切体的表达。聚类分析结果发现高级灵长类动物种间V1C1及V2C2序列相似度大于种内V1C1与V2C2。各物种V1C1与V2C2序列的非同义突变(dN)大于同义突变(dS)值。【结论】B7-H3分子最早以2IgB7-H3形式存在于硬骨鱼动物中;生物信息学及分子生物学方法均证实4IgB7-H3除表达于人类外还可表达于豚鼠、家犬、非洲象、牛、熊猫、蝙蝠及高级灵长类动物如猩猩、猴体内。4IgB7-H3是2IgB7-H3基因复制的结果,该复制事件并非在各物种中独立发生,至少在啮齿类及灵长类动物种为一种普通复制事件。二、人2IgB7-H3和4IgB7-H3蛋白质的空间结构模拟及其受体表达分析【目的】通过蛋白质同源建模法模拟人2IgB7-H3和4IgB7-H3的蛋白质空间构象,分析2种异构体在空间构象上的差异,为其结合不同受体提供理论依据。进而构建2种异构体的融合蛋白分析其与活化T细胞上未知受体的结合,并通过竟争结合实验观察其是否具备结合不同受体的可能性。【方法】获取2IgB7-H3和4IgB7-H3蛋白质序列后,去除其信号肽、跨膜区及胞内段,通过PSI-BLAST搜寻同源序列、mgenthreader进行折叠相似搜索;使用Modeller进行蛋白质结构模拟,并进行优化。生物素标记2种异构体的融合蛋白;通过磁珠分化法从PBMC中获取CD3+T细胞,PHA体外活化24小时,分别用2种生物素标记的融合蛋白结合活化T细胞及与用未标记融合蛋白孵育过的活化T细胞结合,流式细胞仪检测结合。【结果】B7-H3分子中有222个氨基酸与3bisA(PD-L1)的蛋白质氨基酸序列具有36%的同源性,因此以PD-L1晶状体结构为模板模拟B7-H3分子的空间构象。2种异构体具备不同的空间结构。2种异构体的融合蛋白均可结合于活化的T细胞上,该结合可被同种异构体的融合蛋白所阻断;而另一种异构体的融合蛋白不影响其结合。【结论】成功模拟人2IgB7-H3和4IgB7-H3两种蛋白质的空间结构,其具备不同的空间构象。活化的T细胞上可能表达两种受体与B7-H3的2种异构体相结合。三、人2IgB7-H3和4IgB7-H3生物学功能差异研究【目的】利用人2IgB7-H3和4IgB7-H3、小鼠B7-H3的基因转染细胞和融合蛋白,研究B7-H3对活化T细胞的作用及在LPS介导的单核细胞抗感染免疫的功能,寻找其生物学功能的差异。【方法】分离获得人外周血PBMC细胞,磁珠分化获得CD3+T细胞和CD14+单核细胞。在CD3、CD28单抗的存在下,使用不同数量的人2IgB7-H3和4IgB7-H3基因转染细胞和不同浓度的融合蛋白作用于活化T细胞,72小时ELISA检测T细胞增殖情况和细胞因子IL-2、IFN-γ的分泌情况。在LPS存在下,使用不同数量的人2IgB7-H3和4IgB7-H3基因转染细胞和不同浓度的融合蛋白作用于单核细胞,24小时ELISA检测细胞因子IL-6、TNF-α的分泌水平。获得正常小鼠脾脏,研磨磁珠分离获得CD3+T细胞和CD11b+单核细胞,按上述研究方法分析对小鼠T细胞和单核细胞作用。【结果】人2IgB7-H3与小鼠B7-H3基因转染细胞对体外培养3天的T细胞具有促进增殖、活化,增强IL-2、IFN-γ的分泌,与对照相比具有统计学差异(P<0.01)。以上2种基因转染细胞在LPS介导下明显增强单核细胞的活化,增加IL-6、TNF-α的分泌。人4IgB7-H3基因转染细胞对体外培养3天的T细胞具有抑制增殖、活化,降低IL-2、IFN-γ的分泌,对单核细胞无明显生物学作用。【结论】活化T细胞上可表达两种受体与B7-H3相结合。人2IgB7-H3与小鼠B7-H3与刺激性受体相结合,发挥促进T细胞的活化与增强单核细胞的功能;而人4IgB7-H3可与抑制性受体结合对T细胞的活化具有抑制作用。四、人4IgB7-H3分子“PQRSPT”基序的生物学特性的研究【目的】分析序列高度重复的人4IgB7-H3与2IgB7-H3两种异构体之间结构域的差异,并探讨该差异与可溶性B7-H3的产生及介导的生物学功能中的相关性。【方法】通过氨基酸序列比对方法分析人4IgB7-H3与2IgB7-H3两种异构体的序列差异,并通过拼接PCR的方法获得表达缺失6个保守性氨基酸(PQRSPT)的4IgB7-H3-Del基因。将该目的片段双酶切后与pIRES2-EGFP真核表达载体连接,构建重组真核表达载体pIRES2-EGFP/4IgB7-H3-Del并通过脂质体转染法将其导入L929细胞;RT-PCR、流式细胞术和Western blot检测转染细胞B7-H3的表达;Western blot和ELISA法检测细胞培养上清中sB7-H3的表达。将不同浓度的4IgB7-H3-Del转染细胞与活化T细胞共同作用,72小时后CCK-8检测T细胞增殖情况,ELISA检测细胞因子IL-2、IFN-γ的分泌水平。【结果】酶切和测序结果均证实插入的目的基因序列正确,成功构建真核表达载体并获得4IgB7-H3-Del基因转染细胞;流式细胞术、ELISA和Western blot检测结果表明,4IgB7-H3转染细胞表面高表达B7-H3蛋白,细胞培养上清中无sB7-H3蛋白,而4IgB7-H3-Del转染细胞高表达B7-H3蛋白,其培养上清中有大量sB7-H3的存在。4IgB7-H3-Del转染细胞对活化的T细胞无明显作用,与对照相比无统计学差异。【结论】成功构建4IgB7-H3-Del基因转染细胞,其保守性氨基酸“PQRSPT”成为人4IgB7-H3不能形成可溶性形式及发挥T细胞抑制作用的重要结构域。综上所述,本研究通过生物信息学结合分子生物学的方法探讨B7-H3分子2种异构体在不同物种中的分布表达,继而通过分子聚类和序列分析探讨4IgB7-H3外显子复制的可能模式和目的。通过研究发现在外显子复制过程中产生的保守性氨基酸“PQRSPT”可成为人4IgB7-H3不能形成可溶性形式及对活化T细胞产生抑制作用的重要基序。蛋白质建模发现氨基酸高度重复的2种异构体具备不同的空间构象,融合蛋白结合实验推测其可结合不同的受体发挥生物学功能。体外实验对活化T细胞和单核细胞的作用证实了第二部分的实验结果。人2IgB7-H3与小鼠B7-H3基因可促进活化T细胞的增殖,增强单核细胞的作用;人4IgB7-H3主要表达于抗原递逞细胞中可发挥介导抑制T细胞活化的生物学功能。