细胞珠蛋白(CYGB)是日本科学家在十几年前对纤维化的肝脏进行蛋白质组学分析时首次发现的一种球蛋白,最早被命名为星状激活蛋白(Stellate Activating Protein)。与其他球蛋白家族成员一样,CYGB具有与呼吸和压力相关的一些活性。CYGB参与氧的贮存、运输和传感,具有末端氧化酶和一氧化氮双加氧酶活性,还具有清除活性氧(ROS)的功能。据报道,CYGB还具有良好的细胞保护作用,它可以保护细胞使其免遭ROS/RNS的损伤,在低氧和氧化应激的不良环境中有效地保护细胞,抑制DNA损伤。CYGB与多种疾病的发生发展相关,如肝脏、肾脏、胰腺等组织器官的纤维化,青光眼,胃管反流以及一些神经退行性疾病。近年来,肿瘤相关的CYGB研究成为又一研究热点,CYGB很可能像E-钙黏蛋白一样具有两面性,在一些癌症中发挥抑癌基因的作用,在一些癌症中又具有原癌基因的特性。CYGB具有多种生物学功能,本课题组的前期研究结果表明重组人源细胞珠蛋白可以有效逆转大鼠肝纤维化和动脉粥样硬化,CYGB与癌症的关联性也是当前的研究热点。但是CYGB的作用靶点还未知,其作用的分子机制、参与的信号分子通路都不甚明了。因此,本研究通过酵母双杂交系统筛选Mate & PlateTM Library-Universal Human (Normalized)人源标准化cDNA文库,寻找与CYGB相互作用的蛋白,为进一步研究CYGB的功能机制奠定基础。本研究通过酵母双杂交筛选出17个与CYGB相互作用的蛋白,环指蛋白2(RNF2)是其中之一。我们通过酵母回复性杂交实验和免疫共沉淀实验进一步验证CYGB与RNF2之间的相互作用。环指蛋白2(RNF2)属于多梳家族,是多梳抑制复合物1(PRC1)中的一员。RNF2可以介导组蛋白H2A的泛素化,因此RNF2在多梳结构介导的基因抑制中发挥重要作用。RNF2作为PRC1家族的一员,在胃癌、结肠癌、淋巴癌等多种癌症中高表达。RNF2具有原癌基因的活性,敲除RNF2的HeLa细胞形态会发生改变,细胞增殖也会受到抑制。RNF2是一种E3连接酶,与P53具有直接的相互作用,在人结肠癌HCT1 16细胞系中它可以以p53为靶点通过蛋白酶体途径,促进p53的降解,从而影响P53下游基因的表达水平,以调节细胞周期和细胞凋亡。据此,我们推测CYGB与RNF2之间的相互作用很可能与肿瘤的发生发展具有一定的关联性。本研究共分为四章：第一章是CYGB酵母诱饵表达载体的构建、表达与自毒性、自激活检测；第二章应用酵母双杂交系统在Mate & PlateTM Library-Universal Human (Normalized)人源标准化cDNA文库中筛选细胞珠蛋白的相互作用蛋白；第三章是通过酵母回复性杂交实验和免疫共沉淀实验验证CYGB与RNF2的相互作用；第四章过表达CYGB诱导人结肠癌HCT116细胞中RNF2及其相关基因的mRNA水平变化的检测。第一章,以pET28a-CYGB质粒为模板通过PCR扩增得到CYGB编码序列,将其酶切后连接至pGBKT7酵母表达质粒,酶切、PCR与测序鉴定其阳性克隆；随后将重组质粒pGBKT7-CYGB转化入Y2H Gold酵母菌株,通过Western-blot检测BD-CYGB-MYC融合蛋白在Y2H Gold酵母菌株中的表达;分别将pGBKT7-CYGB质粒和pGBKT7质粒小规模转化入酵母感受态细胞,转化产物分别涂布于SD/-Trp平板,以检测诱饵蛋白是否会对Y2H Gold酵母菌株产生自毒性；同时将pGBKT7-CYGB转化产物涂布于SD/-Trp/X-α-Gal和SD/-Trp/X-α-Gal/AbA平板,以检测诱饵蛋白是否会自激活报告基因。实验结果显示,将CYGB基因克隆到了pGBKT7酵母表达质粒,经PCR、双酶切和测序鉴定,成功构建了pGBKT7-CYGB重组表达载体：用抗MYC抗体对表达产物进行Western-blot鉴定,转化空载体pGBKT7的Y2H Gold酵母菌株表达大小为20kDa左右的BD-MYC载体蛋白,转化重组质粒pGBKT7-CYGB的Y2H Gold酵母菌株表达的蛋白分子量大小为42kDa左右,CYGB的理论分子量为21kDa左右,与对照相比,符合预期。说明pGBKT7-CYGB重组质粒在Y2H Gold酵母菌株中成功表达BD-CYGB-MYC融合蛋白；在SD/-Trp平板上,酵母转化子Y2HGold-pGBKT7-CYGB和Y2H Gold-pGBKT7生长速度和菌落大小及数目基本没有差别,证明CYGB诱饵蛋白对Y2H Gold酵母细胞无毒性作用；在SD/-Trp/X-α-Gal平板上含诱饵质粒的酵母菌落未变蓝,SD/-Trp/X-α-Q-Gal/AbA平板上无菌落长出,证明该诱饵质粒无自激活活性。实验结果表明,pGBKT7-CYGB酵母诱饵表达载体构建成功,可以用于文库筛选。第二章,首先进行阴阳性对照实验：阳性对照Y2HGold[pGBKT7-53]和Y187[pGADT7-T];阴性对照Y2HGold[pGBKT7-Lam]和Y187[pGADT7-T]。将杂交产物涂布于缺陷培养板,培养3天后,观察菌落的生长情况和颜色变化；以pGBKT7-CYGB重组质粒为诱饵从Mate & PlateTM Library-Universal Human (Normalized)文库中筛选CYGB的相互作用蛋白。从第三次SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade-X-α-Gal/AbA(QDO/X/A)平板上筛选出的蓝色克隆中提取酵母表达质粒,PCR扩增文库质粒中插入的cDNA片段,对PCR产物进行测序分析,测序结果在NCBI中进行比对,对比对结果进行进一步分析。实验结果显示,阳性对照的杂交菌株能够在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal/AbA(QDO/X/A)筛选平板上生长,且菌落呈蓝色；阴性对照的杂交菌株无法在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal/AbA(QDO/X/A)筛选平板上生长。说明整个酵母双杂交系统正常,可以进行酵母双杂交文库筛选实验；以pGBKT7-CYGB重组质粒为诱饵从Mate & PlateTM Library-Universal Human (Normalized)文库中筛选CYGB的相互作用蛋白,在严苛的QDO/X/A平板反复筛选三次,最终得到32个蓝色的阳性克隆;PCR扩增文库质粒中插入的cDNA片段,PCR得到的插入片段大小均在1000bp-2500bp之间；进一步对阳性克隆质粒的PCR产物进行测序鉴定,测序结果在NCBI中进行比对,初步得到了17个CYGB的相互作用基因。其中RNF2.SLC7A13.ATPlB1这三个基因重复出现多次。RNF2基因一共重复出现11次,并且与癌症相关,所以我们以RNF2为目标蛋白进行进一步的蛋白质相互作用的验证和深入研究。RNF2是一种E3连接酶,它可以以p53为靶点,促进p53的降解,而p53的上调不会影响RNF2的表达水平。RNF2的E3连接酶活性依赖于另一种PRC1家族成员Bmil的存在。RNF2的敲除可以诱导细胞的凋亡,而这种诱导作用可以通过降低p53的表达水平而减弱。在胚胎细胞中降低RNF2的表达水平可以显著抑制肿瘤细胞的增殖。在体外和肿瘤的异种移植物模型中,同时下调RNF2和p53将恢复肿瘤细胞的增殖水平。RNF2以p53为靶点在一些细胞系中发挥原癌基因的功能。第三章,通过酵母回复性杂交实验和免疫共沉淀实验进一步验证CYGB与RNF2之间的相互作用。分别将下列两对载体(100ng)共转化入Y2H Gold酵母感受态中：实验组-pGBKT7-CYGB+pGADT7-RNF2,对照组-pGBKT7+pGADT7-RNF2;将转化产物分别涂布于SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal和SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade-X-α-Gal/AbA固体培养板,30℃倒置培养3天,观察转化后的Y2H Gold酵母菌株的生长和颜色变化情况,初步验证CYGB与RNF2的相互作用；以pET28a-CYGB质粒为模板通过PCR扩增得到CYGB编码序列,将其酶切后连接至pCMV-MYC哺乳动物细胞表达载体,酶切、PCR与测序鉴定其阳性克隆。免疫共沉淀实验：将实验组(pENTER-FLAG-HIS-RNF2+pCMV-MYC-CYGB),对照组(pENTER-FLAG-HIS-RNF2+pCMV-MYC)分别转染入HEK293T细胞。转染48h后,将细胞裂解液加入处理过的ANTI-MYC亲和琼脂糖胶中,振荡混匀,4℃缓慢旋转过夜,7500g离心lmin,弃上清。用预冷的洗涤液(Wash buffer)洗涤ANTI-MYC亲和琼脂糖胶4次,每次lml。加入40μ 1的2×SDS蛋白上样缓冲液,煮沸3min,离心后取上清进行蛋白电泳和Western-blot。实验结果显示,共转化后的实验组和对照组Y2H Gold酵母菌株均可在SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal(DDO/X)培养板上生长,说明两对载体均成功转化入Y2H Gold酵母感受态中；在SD/-Leu/-Trp/X-α-Gal平板上实验组菌落为亮蓝色,对照组菌落为白色,在SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade/X-α-Gal/AbA固体培养板只有实验组长出亮蓝色的菌落而对照组未长出菌落,说明实验组的CYGB和RNF2蛋白发生相互作用,激活了报告基因,提示在酵母中RNF2确实能与CYGB发生相互作用；将CYGB基因克隆到pCMV-MYC哺乳动物细胞表达载体,经PCR、双酶切和测序鉴定,成功构建了pCMV-MYC-CYGB重组表达载体。实验组和对照组细胞裂解液的Western-blot结果显示,对照组只能检测到RNF2的表达,实验组可检测到RNF2和CYGB的表达,说明pENTER-FLAG-HIS-RNF2和pCMV-MYC-CYGB均可在HEK293T细胞中正常表达RNF2和CYGB。免疫共沉淀后洗脱液的Western-blot结果,转染入pENTER-FLAG-HIS-RNF2和pCMV-MYC空载体组没有检测到RNF2蛋白,转染入pENTER-FLAG-HIS-RNF2和pCMV-MYC-CYGB组可以检测到RNF2和CYGB,说明RNF2可以被CYGB共沉淀,说明RNF2和CYGB在HEK293T细胞中发生了相互作用。第四章,通过RT-qPCR检测在人结肠癌HCT116细胞CYGB高表达组和对照组中RNF2及其相关基因的mRNA水平。实验结果显示,与HCT1 16细胞对照组相比,HCT1 16细胞CYGB高表达组的CYGB和RNF2基因的相对mRNA水平分别为2.1592±0.32988,6.2408±0.82304,且差异具有统计学意义(P<0.001),提示过表达后CYGB和RNF2基因的相对mRNA水平升高；HCT116细胞CYGB高表达组的P53和P21基因的相对mRNA水平分别为0.4503±0.09536,0.4237±0.07985,且差异具有统计学意义(P<0.001),提示过表达后P53和P21基因的相对mRNA水平降低。综合以上结果得出结论：1.成功构建了pGBKT7-CYGB重组表达载体,该重组质粒在Y2H Gold酵母菌株成功表达BD-CYGB-MYC融合蛋白,且CYGB诱饵蛋白对Y2H Gold酵母细胞无毒性作用、无自激活活性。实验结果表明,pGBKT7-CYGB酵母诱饵表达载体构建成功,可以用于文库筛选。2.以pGBKT7-CYGB重组质粒为诱饵从Mate & PlateTM Library-Universal Human (Normalized)文库中筛选CYGB的相互作用蛋白,最终得到32个蓝色的阳性克隆。阳性克隆质粒的PCR产物经测序鉴定、比对初步得到了17个细胞珠蛋白的相互作用基因。其中RNF2、SLC7A13、ATP1B1这三个基因重复出现多次。RNF2基因一共重复出现11次,并且与癌症相关,是我们验证和深入研究的重点。3.经酵母回复性杂交实验证明在酵母中RNF2确实能与CYGB发生相互作用。经免疫共沉淀实验证明RNF2和CYGB在HEK293T细胞中发生了相互作用。4.在人结肠癌HCT116细胞中,CYGB过表达可以提高RNF2的mRNA水平,降低P53和P21的mRNA水平。提示CYGB很可能正向调控RNF2,从而影响肿瘤的发生发展。